本发明专利技术公开了一种从水体中提取蓝藻毒素的方法。该方法包括如下步骤：1）向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为3-5%，300赫兹连续超声15-20min；2）将步骤1）超声处理后的水样调节pH为3，用0.45μm滤膜过滤，滤液于6500g离心5-10min，取上清；3）将步骤2）所得上清过固相萃取柱，用体积含量为40%的甲醇水溶液淋洗，再用体积含量为95%的甲醇水溶液洗脱，得到含有蓝藻毒素的洗脱液；4）从步骤3）洗脱液中获得蓝藻毒素。本发明专利技术采用固相萃取技术，连续富集、纯化、提取城市湖泊水体中的两种蓝藻毒素主要异构体MC-LR和MC-RR，具有所得产品纯度高，易于操作，成本低廉等特点。
Method for extracting blue-green algae toxin from urban eutrophic blue-green algae bloom water body
The invention discloses a method for extracting blue-green algae toxins from water bodies. The method comprises the following steps: 1) to add acetic acid methanol and ice to water extraction, the final volume of the methanol content is 40%, the final volume of acetic acid content is 3-5%, 300 Hz continuous ultrasonic 15-20min; 2) in step 1) after ultrasonic treatment of the sample pH was adjusted to 3, with 0.45 mu m filtration, filtrate in 6500g centrifugal 5-10min, Torikami Kiyo; 3) in step 2) over the supernatant of solid phase extraction column, with volume fraction of 40% methanol water solution leaching, with volume fraction of 95% methanol water solution was obtained, the eluent containing cyanobacterial toxins; 4) from step 3) in the eluate obtained cyanobacterial toxins. The invention adopts solid phase extraction, continuous enrichment, purification, extraction of city in lake water two major cyanobacterial toxins isomers MC-LR and MC-RR, with high purity of products, easy operation, low cost etc..
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种从水体中提取蓝藻毒素的方法。该方法包括如下步骤：1）向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为3-5%，300赫兹连续超声15-20min；2）将步骤1）超声处理后的水样调节pH为3，用0.45μm滤膜过滤，滤液于6500g离心5-10min，取上清；3）将步骤2）所得上清过固相萃取柱，用体积含量为40%的甲醇水溶液淋洗，再用体积含量为95%的甲醇水溶液洗脱，得到含有蓝藻毒素的洗脱液；4）从步骤3）洗脱液中获得蓝藻毒素。本专利技术采用固相萃取技术，连续富集、纯化、提取城市湖泊水体中的两种蓝藻毒素主要异构体MC-LR和MC-RR，具有所得产品纯度高，易于操作，成本低廉等特点。【专利说明】
本专利技术属于水环境保护领域，涉及一种从水体中提取蓝藻毒素的方法，特别涉及一种从城市富营养化蓝藻水华水体中提取两种主要蓝藻毒素类型RR和LR的方法。
技术介绍
我国城市水体包括城市周边湿地湖泊、公园景观湖泊、城市河道等。然而最近20年来，随着城市化进程的快速推进，工农业以及生活污水携带着大量的营养盐排入城市湖泊水体中，导致城市水体营养化现象日益严重。水体的富营养化危害最大的一个表征现象就是蓝藻水华的出现，更严重的后果是蓝藻水华能释放蓝藻毒素危害人类和其他生物的安全。研究发现LR型蓝藻毒素(MC-LR)和RR型蓝藻毒素(MC-RR)是毒性最强，分布最广，最为常见的两种藻毒素类型。藻毒素不仅可以通过饮用水威胁动植物健康，而且可以在动植物体内富集，通过食物链的作用威胁人类健康。研究表明蓝藻毒素具有强烈的肝毒性和肿瘤促进作用，可打破生命体的磷酸化和脱磷酸化的过程，从而促进肿瘤的发生。其危害性越来越得到世界范围内的关注。尽管目前有关藻毒素形成及其生理生化方面的研究报道越来越多，但国际上藻毒素标准品价格仍非常昂贵，这也极大的限制了藻毒素相关研究的发展。我国富营养化城市湖泊众多，尤其夏秋季蓝藻水华现象频繁发生，藻毒素含量较大，这也为藻毒素提取制备提供了天然的物质基础。然而令人遗憾的是目前有关城市湖泊藻毒素污染并未得到重视，每逢蓝藻发生，通常打捞到岸边或用化学试剂杀灭，这不仅严重污染了土壤和水质，也造成藻毒素资源的浪费。当前传统的藻毒素提取方法通常为从制备的藻粉中提取。然而藻粉制备一为将打捞上来的蓝藻在岸边曝晒阴干，然后将其收集粉碎，这种方法在阴干过程中使得大量的藻细胞死亡腐败，极大的危害了岸边附近的土壤，而且其腐败散发的挥发性气体也污染了周围的空气，且不利于藻毒素的提取和纯化。二为实验室用冷冻干燥设备进行藻粉制备，虽然这种方法较好的控制了藻粉制备污染问题，但其制备量有限，且提取成本较高，不适合大量藻毒素提取。此外，目前藻毒素提取多针对MC-LR类型，MC-RR类型较少，这也是为何市场上MC-RR类型藻毒素价格更高的原因之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从水体中提取蓝藻毒素的方法，特别是从城市蓝藻水华水体中提取主要蓝藻毒素类型LR和RR的方法。本专利技术所提供的从水体中提取蓝藻毒素的方法，具体可包括如下步骤:(I)取待提取水体，向其中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为3-5%，300赫兹连续超声15-20min ；(2)将步骤(1)超声处理后的水样调节pH为3，用0.45 4 111滤膜(如6?/(:玻璃纤维滤膜)过滤，滤液于6500g离心5-10min (如5min或IOmin),取上清；(3)将步骤(2)所得上清过固相萃取柱(SPE柱)，使蓝藻毒素富集到柱子上，用体积含量为40%的甲醇水溶液淋洗，再用体积含量为95%的甲醇水溶液洗脱，得到含有蓝藻毒素的洗脱液；(4)从步骤(3)的洗脱液中获得蓝藻毒素。在上述方法中，若要步骤(4)中获得的蓝藻毒素最大产量RR型蓝藻毒素(MC-RR)，则所述方法的步骤(I)为:向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为3%，300赫兹连续超声15min ;若要步骤(4)中获得最大产量LR蓝藻毒素，则所述方法的步骤(I)为:向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为5%，300赫兹连续超声20min。在上述方法的步骤(I)中，在所述向待提取水体中加入甲醇和冰醋酸之前，还可包括如下步骤:将所述待提取水体过100目网筛(去除水体中的大部分悬浮物)，将过筛后水样用500g离心去沉淀(去除较小颗粒悬浮物)。在上述方法的步骤(3)中，所述固相萃取柱可为C18固相萃取柱。在专利技术中，所述C18固相萃取柱具体为Cleanert C18-SPE层析柱(天津博纳艾杰尔科技有限公司产品)。步骤(3)中，在将步骤(2)所得上清过固相萃取柱之前，需先用I倍柱体积的甲醇和2倍柱体积的水(Mill1-Q水)先后冲洗所述固相萃取柱，使之活化。将步骤(2)所得上清过所述固相萃取柱时的流速可为5-10ml.mirT1 (如5ml.mirT1)。在上述方法的步骤(4)中，所述从步骤(3)的洗脱液中获得蓝藻毒素的方法具体可包括如下(a)和(b)的步骤:(a)将所述洗脱液浓缩，得到蓝藻毒素的浓缩液，溶剂为甲醇；(b)用高效液相色谱仪串联质谱仪对步骤(a)所得浓缩液进行鉴定与分离，从所述浓缩液中分别得到所述RR型蓝藻毒素和所述LR型蓝藻毒素。在上述方法中，进行所述步骤(b)时，采用的高效液相色谱条件具体如下:色谱柱为C18色谱柱，具体如Welch Ultimate XB-C18色谱柱(4.6mmX 150mm,粒径5 μ m);流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；流动相A:甲醇；流动相B:体积百分含量为0.1%的甲酸水溶液；所述梯度洗脱为:0?3min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比从30:70线性变化到75:25 ；4?8min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为75:25 ；9?12min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比从75:25线性变化到30:70 ;采用的质谱条件如下:正离子电离方式；喷雾电压(IS)为5kV ;离子化温度(TEM)为500°C;源内气体I (GS1，N2)压力为55kPa，源内气体2 (GS2，N2)压力为55kPa ;扫描方式为选择离子模式，选择质荷比为519.8或995.6 (MC-RR的质荷比为519.8，MC-LR的质荷比为995.6);碰撞气压力为Medium级;碰撞电压为35V或50V (MC-LR碰撞电压50V，MC-RR碰撞电压35V)。在以上所述的高效液相色谱条件中，流速可为0.8ml/min，上样体积可为5_10 μ L(如5 μ L)，柱温可为30。。。在上述方法中，所述高效液相色谱仪为Ultimate3000型高效液相色谱仪(Dionex, USA);所述质谱仪为3200Q TRAP型串联质谱仪(Aglient，USA)。在上述方法中，所述步骤(b)具体为:采用以上所述的色谱条件和质谱条件对所述浓缩液进行鉴定与分离，收集与RR型蓝藻毒素标准品保留时间(5.14min)—致的洗脱峰，从而实现从所述浓缩液中分离得到所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种从水体中提取蓝藻毒素的方法，包括如下步骤：（1）取待提取水体，向其中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的终体积含量为40%，使冰醋酸的终体积含量为3?5%，300赫兹连续超声15?20min；（2）将步骤（1）超声处理后的水样调节pH为3，用0.45μm滤膜过滤，滤液于6500g离心5?10min，取上清；（3）将步骤（2）所得上清过固相萃取柱，用体积含量为40%的甲醇水溶液淋洗，再用体积含量为95%的甲醇水溶液洗脱，得到含有蓝藻毒素的洗脱液；（4）从步骤（3）的洗脱液中获得蓝藻毒素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曲疆奇，张清靖，辛知明，朱华，
申请(专利权)人：北京市水产科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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