用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法技术

本发明专利技术公开了一种用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法；本发明专利技术采用超高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用技术对自然品种水稻种子提取物进行分析得到水稻代谢轮廓谱，进而获得各代谢物在不同自然品种水稻中的浓度变化范围，即为代谢物在自然品种水稻中的自然变异范围；在相同的测试条件下，对转基因水稻种子提取物进行分析，分析结果与自然变异范围进行比较：超过自然变异范围的，说明该代谢物的变化是非预期的；在自然变异范围内的，说明该转基因水稻和自然品种在种子代谢组水平实质上是等同的。本发明专利技术的分析方法具有高灵敏度、高通量的优点，由于考虑了代谢物的自然变异范围，此方法可以为深入研究转基因水稻的安全性提供根据。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种；本专利技术采用超高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用技术对自然品种水稻种子提取物进行分析得到水稻代谢轮廓谱，进而获得各代谢物在不同自然品种水稻中的浓度变化范围，即为代谢物在自然品种水稻中的自然变异范围；在相同的测试条件下，对转基因水稻种子提取物进行分析，分析结果与自然变异范围进行比较：超过自然变异范围的，说明该代谢物的变化是非预期的；在自然变异范围内的，说明该转基因水稻和自然品种在种子代谢组水平实质上是等同的。本专利技术的分析方法具有高灵敏度、高通量的优点，由于考虑了代谢物的自然变异范围，此方法可以为深入研究转基因水稻的安全性提供根据。【专利说明】
本专利技术涉及分析化学领域，具体涉及一种。
技术介绍
转基因作物是指利用基因工程技术将目的基因转到受体基因组中形成的改良后的作物。转基因作物可以提高作物的产量，改善品质和营养价值，增强抗虫抗病抗旱等抗性。到目前为止全世界已经有196个转基因事件被商业化，包括转基因牛羊、转基因鱼虾、转基因粮食、转基因蔬菜和水果。然而公众对转基因作物安全性的担忧一直没有停止过，一方面是对食用转基因食品的安全方面的担忧，担心外源性蛋白是否对人有毒性，转基因食品中过敏蛋白含量是否会增加。另一方面是对转基因作物对生态环境的影响，担心抗性基因会扩散到环境中的其他作物，特别是其野生的亲缘物种中，从而产生超级杂草。对于消费真来说，当转基因作物及其衍生物被用于食品或者饲料时，其安全性备受争议。研究人员一直在为转基因安全性评价作努力，经济合作与发展组织(Organization forEconomic Cooperation and Development,OECD)在 2006 年首先提出了“实质等同”原则用于评价转基因作物的安全性，该原则又被联合国粮食和农业组织(Food and AgricultureOrganization of the United Nations)及世界卫生组织(World Health Organization)所细化。实质等同的概念是如果一种食物或者食物成分与已经存在的食物或者食物成分实际上是相同的，那么它就可以作为普通食物安全对待，即它可以被看成与传统食物具有相同的安全性。它包扩三个层次的内容:化学成分等同，食用效果等同，环境影响等同。近些年，许多研究都关注转基因作物的组学水平的变化。这些组学方法被认为是具有高通量、高精度和更强可靠性的非靶标的方法，包括cDNA微阵列，微小RNA指纹，蛋白质组，代谢组和毒理性轮廓。应用代谢组学方法评价转基因作物的安全性已经非常普遍和成功。之前的代谢组学研究基本上都是将转基因作物的代谢组与其受体的代谢组进行比较，这种方法忽视了品种间的自然变异，有可能导致对代谢组数据的误读，即我们不能仅仅根据转基因作物的代谢组和其受体的代谢组有差异就认为该转基因作物是否安全。所以我们迫切需要将作物品种的自然变异纳入到转基因作物安全性评价体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种将作物品种的自然变异纳入到转基因作物安全性评价体系的。本专利技术利用基于超高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联系统对生产上常用的水稻亲本的种子进行代谢轮廓分析，分析获得各种代谢物在不同水稻品种中的变化范围，并将此自然变异用于对转基因和非转基因水稻种子的代谢差异进行研究。该方法具有高灵敏度、高通量的优点。由于考虑了代谢物的自然变异范围，此方法可以为深入研究转基因水稻的安全性提供根据。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的:本专利技术涉及一种，所述方法包括如下步骤:A、采用超高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用技术对自然品种水稻种子提取物进行分析得到水稻代谢轮廓谱，进而获得各种代谢物在不同自然品种水稻中的浓度变化范围，即为代谢物在自然品种水稻中的自然变异范围；B、在与步骤A相同的测试条件下，采用超高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用技术对转基因水稻种子提取物进行分析，分析结果与步骤A中的自然变异范围进行比较；代谢物浓度变化超过自然变异范围的，说明该代谢物的变化是非预期的，代谢物浓度变化在自然变异范围内的，说明该转基因水稻和自然品种在种子代谢组水平实质上是等同的。优选地，所述自然品种水稻种子包括所述转基因水稻种子的受体水稻种子；所述转基因水稻是以非转基因水稻为受体进行基因插入，经过自交并选择具有高赖氨酸蛋白特性的转基因水稻。优选地，所述自然品种水稻种子为中国水稻数据库中包含的核心骨干品种。优选地，所述对水稻种子提取物进行分析具体包括如下步骤:a、取水稻种子样品，分别在液氮中研磨成粉末；b、所述样品粉末中加入超纯水，震荡悬浮，悬浮液中加入提取液用以沉淀样品中的蛋白质，离心后，每种样品取三份上清液，氮气下吹干后冷冻抽干，形成三份待测样品，分别进行LC (+)，LC㈠，和GC-MS分析；C、将步骤b中LC(+)，LC(_)，和GC-MS分析获得的每个品种每种代谢物的浓度转化为标准分数z-score;将水稻种子代谢物浓度(C)取对数(即:log2C)，对应的z-score= (Log2C-mean) / SD，其中，C为所有品种(包括自然品种、转基因品种及其受体)每种代谢物三个生物学重复浓度的均值，mean为所有自然品种中每种代谢物浓度均值，SD为自然品种中每种代谢物的标准偏差。优选地，所述对水稻种子提取物进行分析还包括:采用参照检测组分别进行LC (+)，LC㈠，和GC-MS分析，用于检测分析系统的稳定性；所述参照检测组选自所述步骤b中的三种待测样品混合形成的待测混合物、人的血浆样品、水中的一种或几种。优选地，所述步骤b中待测样品用于LC⑴分析时具体为:在待测样品中加入LC(+)稀释液后，采用超高效液相色谱-质谱联用法(UHPLC-MS)测定代谢物，并使用UHPLC-MS (+)模式进行分析。优选地，所述步骤b中待测样品用于LC(_)分析时具体为:在待测样品中加ALC(-)稀释液后，采用超高效液相色谱-质谱联用法(UHPLC-MS)测定代谢物，并使用UHPLC-MS (-)模式进行分析。优选地，所述步骤b中待测样品用于GC-MS分析时具体为:在待测样品中加入稀释溶剂和衍生化试剂进行衍生化反应，离心后放入GC / MS上样室进行检测。优选地，所述对水稻种子提取物进行分析还包括:用生物统计分析软件-R软件将步骤C得到的Z-score值转化成ζ-plot图。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果:1、本专利技术的方法具有简单、快速、重复性好、高灵敏度、高通量等优点，适用于实际样品的批量分析。2、本专利技术建立的水稻代谢轮廓分析方法能够降低在实验过程中引起的误差，方法验证结果良好。3、通过质量控制(QC)，实现了对仪器运行过程中保留时间和相应信号的监控，确保了数据的可靠性；而选自所述步骤b中的三种待测样品混合形成的待测混合物、人的血浆样品、水的参照检测组的选用为代谢物测定的质量控制提供了重要的保证。【专利附图】【附图说明】通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显:图1为高赖氨酸转基因水稻、受体水稻及其他103个自然品种水稻种子中121种代谢物的Z-score图，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用自然变异分析转基因水稻代谢差异的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A、采用超高效液相色谱?质谱联用和气相色谱?质谱联用技术对自然品种水稻种子提取物进行分析得到水稻代谢轮廓谱，进而获得各种代谢物在不同自然品种水稻中的浓度变化范围，即为代谢物在自然品种水稻中的自然变异范围；B、在与步骤A相同的测试条件下，采用超高效液相色谱?质谱联用和气相色谱?质谱联用技术对转基因水稻种子提取物进行分析，分析结果与步骤A中的自然变异范围进行比较；代谢物浓度变化超过自然变异范围的，说明该代谢物的变化是非预期的，代谢物浓度变化在自然变异范围内的，说明该转基因水稻和自然品种在种子代谢组水平实质上是等同的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张大兵，石建新，胡朝阳，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：