本发明专利技术涉及一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，包括下述步骤：（１）获取在培养液中稳定分散的粒径小于１００ｎｍ的二氧化钛纳米颗粒；（２）对二氧化钛纳米颗粒处理的细胞模型组和正常细胞对照组进行小分子代谢物的测定，根据谱图变化评估二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性；（３）采用统计方法建立不同来源组的数学模型；（４）根据细胞中差异代谢物的变化，构建代谢网络；（５）探讨二氧化钛颗粒影响细胞的代谢机制，综合评价二氧化钛纳米颗粒与细胞生物安全性之间的关系。与传统纳米颗粒细胞生物安全性评价的方法相比，本发明专利技术的方法可以快速、准确地寻找到与二氧化钛纳米颗粒诱发代谢网络紊乱相关的关键代谢物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米颗粒的细胞生物安全性评价领域，具体地说，是一种从代谢网络变化的角度评价二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法。
技术介绍
纳米颗粒因具有尺寸效应、体积效应和表面效应等特殊性能，被广泛应用在工业生产和生物医药领域，用来提高原有产品的性能或获得新的功能。然而，随着纳米材料的大量商品化，纳米颗粒类物质的生物安全性问题如对环境和人类健康可能带来的危害等倍受关注。目前，关于纳米颗粒的生物安全性研究主要集中在整体动物效应(包括对生理功能的影响)、细胞生物学效应及其机制、大气纳米颗粒对人体作用和影响等领域，并一致认为纳米颗粒的剂量、粒径、形状、化学组成、分散状态、表面特征如表面电荷、化学物修饰等是影响细胞行为和功能的主要因素。纳米二氧化钛，具有优异的紫外线屏蔽性和良好透明性等特点，已成为防晒化妆品的理想原料。同时，由于二氧化钛电子结构所具有的特点，光催化作用持久，具有持久的杀菌、降解污染物效果。此外，纳米二氧化钛还常被应用于催化剂、医药卫生和食品添加剂等。二氧化钛纳米颗粒主要通过皮肤(化妆品)、呼吸(工业生产)、摄入(药物、食品)和血液循环等途径进入人体。关于纳米二氧化钛的生物安全性研究主要集中在器官恶化、细胞形态学和生物氧化层面(高峰，蓝闽波，袁慧慧，黄永平，刘建文，赵红莉，王芬，2010，专利号 CN101671722A)，而纳米二氧化钛对细胞内各种细胞器、生物大分子、遗传信息的破坏机制尚待明确。Kang 等人(Kang, S. J. Kim, B. M. Lee, Y. J. Chung, H. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2008, 49: 399-405)发现二氧化钛纳米颗粒触发了与细胞周期相关的功能性蛋白P53磷酸化。尽管人们已逐步关注到只有在系统水平上对所有成分整体分析才能全面正确的认识生物体的多种生理功能，研究二氧化钛纳米颗粒的生物安全性也开始涉及系统生物学层面，Bu 等人(Bu, Q. Yan, G. Deng, P. Peng, F. Lin, H. Xu, Y. Cao, Ζ. Zhou, Τ. Xue, Α. Wang, Y. Cen, Χ. and Zhao, Y. Nanotechnology, 2010，21: 125105 (12pp)) 利用核磁共振波谱仪(NMR)技术研究发现口服二氧化钛纳米颗粒的大鼠，其体液代谢小分子均出现不同程度的变化。然而，从代谢分子水平研究二氧化钛纳米颗粒如何诱导细胞坏死和凋亡的代谢机制尚不清楚。因此，有必要建立代谢网络，通过观察细胞代谢网络中不同代谢物的变化，寻找二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的代谢标志物和作用靶点，全面解析二氧化钛纳米颗粒诱导细胞损伤的内在代谢通路。迄今为止，通过细胞构建的代谢网络变化评价二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性和潜在代谢机制尚无报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提供一种纳米颗粒的细胞生物安全性的评价方法，主要内容为测定与二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性密切相关的代谢差异物，通过分析技术结合统计学方法，研究二氧化钛纳米颗粒影响细胞能量代谢(如糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、三羧酸循环)、戊糖磷酸途径、核苷酸代谢、脂代谢、氨基酸代谢的过程，寻找二氧化钛纳米颗粒对细胞的作用靶点，综合评价二氧化钛纳米颗粒诱发细胞代谢网络变化的机制，这将有助于从代谢层面评估二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性的影响。本专利技术是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤第一步，纳米颗粒的分散选用在培养液中中性的、分散性好的、性能稳定的、粒径小于 IOOnm的锐钛矿型纳米二氧化钛，并且也可以采用其它晶型的二氧化钛纳米颗粒。第二步，细胞培养和模型建立根据二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性评价需要，筛选建立二氧化钛纳米颗粒处理的细胞模型，以及相应的正常对照。选用标准细胞接种于培养皿上，并使用培养液进行培养。模型组中根据二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性评价需要，待细胞长至60%后，改用灭菌的含有上述第一步中的二氧化钛纳米颗粒的培养液培养。第三步，样品前处理采用细胞破碎和溶剂提取方式获取细胞中小分子代谢物； 根据样品分析方法，样品提取物可以不进行衍生处理，也可以利用衍生化试剂进行衍生处理。第四步，样品的分析和数据处理采用质谱联用方法或/和核磁共振(NMR)方法对细胞处理后样品进行成分检测和分析，获得谱图中各物质的峰高或峰面积强度。第五步，统计学方法采用单维统计和多维统计方法比较二氧化钛纳米颗粒处理的细胞模型组和正常细胞对照组，获得二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的差异代谢物。第六步，代谢网络的建立及分析根据细胞中糖类、脂类、氨基酸类、核酸类等代谢物变化，构建中心代谢网络，寻找与二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性相关的代谢网络变化和标志性特点，揭示二氧化钛纳米颗粒作用于细胞后影响的位点和途径等相关信息。从代谢网络变化的角度，综合评价二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性揭示其代谢机制。所述第二步中细胞为各种类型细胞。所述第二步中的细胞优选为小鼠成纤维(L929)细胞，也可以是人、小鼠、大鼠、兔子、犬、猴类等其它各种类型细胞。所述第二步中二氧化钛纳米颗粒的剂量应至少为100μ g/mL，培养时间为24_72 小时。所述的第二步中二氧化钛纳米颗粒处理的模型组样本和正常对照组样本数分别不少于10个。所述第三步中的细胞破碎方法包括溶剂法、超声破碎法和压力破碎法。所述第三步中的衍生试剂包括各种硅烷化试剂、酰化试剂和脂肪酸酯化试剂。所述的第四步采用代谢谱图评估色谱峰的强度与不同剂量的二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性之间的相关性。所述的第六步中，代谢网络的建立和代谢机制的分析涉及了不同的代谢通路，考察与细胞能量作用相关的糖代谢、脂代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢和核苷酸代谢的变化是评价二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的关键因素。本专利技术的有益效果传统的纳米颗粒生物安全性评价方法所反映的仅是形态学和生化指标的变化，本专利技术通过检测二氧化钛纳米颗粒诱导细胞病变的差异代谢物，构建代谢网络，分析多个代谢途径的变化，有助于寻找到二氧化钛纳米颗粒作用细胞的靶点和途径，为二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性的科学评价提供了一种有效的手段和方法。、本专利技术的实施例可以看出，在二氧化钛纳米颗粒作用下，细胞内多个小分子代谢物出现显著变化，这种变化可反映二氧化钛纳米颗粒影响了代谢网络中多条代谢通路，其中尤以与能量作用相关的代谢物在细胞内水平降低为特点。、与现有技术不同，在细胞构建的代谢网络中，代谢物水平的变化不仅可直接评估二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性的影响，而且通过该安全性评价结果能更客观、更深入地了解细胞病变的代谢机制。附图说明图1为二氧化钛纳米颗粒的粉末X射线衍射(XRD)谱、透射电镜图和激光光散射图。图2为不同剂量二氧化钛纳米颗粒处理的细胞样本的总离子流色谱图 (TIC)0当二氧化钛纳米颗粒的剂量超过ΙΟΟμ g/mL时，从细胞的色谱图中发现一些代谢物强度随着二氧化钛纳米颗粒的剂量增加而逐渐下降。1，丙酮酸(Pyruvic acid) ;2，乳酸 (2-Hy droxypropano i c acid);3,L-a -丙M酸(本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，二氧化钛纳米颗粒的分散：将二氧化钛纳米颗粒分散在培养液中；第二步，细胞培养：选用细胞接种于培养皿上，待细胞长至６０％左右后，改用新鲜灭菌的第一步中的二氧化钛纳米颗粒的培养液培养；第三步，样品检测和分析：收集并提取二氧化钛纳米颗粒处理的模型组和正常对照组的细胞代谢物，分别采用色谱质谱联用技术或／和核磁共振技术对其进行检测、分析和数据处理，获取模型组和对照组的代谢谱图；第四步，统计分析：采用单维统计和多维统计方法比较二氧化钛纳米颗粒处理的细胞模型组和正常细胞对照组，寻找二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的差异代谢物；第五步，代谢网络的建立及机制分析：构建代谢网络，分析不同代谢作用在二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性研究中的意义，考察二氧化钛纳米颗粒诱导的代谢通路变化，并综合评价二氧化钛纳米颗粒与细胞生物安全性之间的关系。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金承钰，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31
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