重组双靶点蛋白药物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一类用于抗肿瘤治疗的双靶点抗肿瘤重组蛋白药物OC001及其构建及运用。本发明专利技术还提供了该类蛋白药物在制备治疗多种肿瘤的药物中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一类用于抗肿瘤治疗的双靶点抗肿瘤重组蛋白药物OC001及其构建及运用。本专利技术还提供了该类蛋白药物在制备治疗多种肿瘤的药物中的用途。【专利说明】重组双靶点蛋白药物及其应用
本专利技术涉及一种重组蛋白质药物，及其用于制备治疗肿瘤的药物中的用途，所述肿瘤主要包括乳腺癌、肝癌等。本专利技术属于生物医药工程领域。
技术介绍
肿瘤细胞的恶性增殖是肿瘤恶性表征的重要标志，这一肿瘤生物学过程包含一系列的细胞信号传导通路的紊乱与异常。大规模系统的肿瘤信号传导通路的筛选表明，下丘脑-垂体-生长轴相关因子在所有已知的促进肿瘤发生发展的信号传导通路中位列第三位。其中生长激素及催乳素激素位于这一机体生长调控轴，在肿瘤的发生和发展过程中起着至关重要的作用。比如生长激素或催乳素得过量表达将显著促进多种肿瘤如乳腺癌和肝癌的发生与发展。因此针对二者的分子靶向治疗途径将大大有助于乳腺癌和肝癌等肿瘤的临床治疗。传统的肿瘤治疗方法包括手术、放疗、化疗和激素疗法，然而总有大量的肿瘤患者对上述传统的肿瘤治疗方法不敏感从而导致治疗失败。传统的化疗药物的缺陷表现为:1)对肿瘤细胞和正常细胞同样都具有毒性；2)由于肿瘤细胞在基因组上的不稳定性，经过长期的化疗，将导致耐药性的克隆株 的出现而导致治疗失效。本专利技术的多肽作为人生长激素与人催乳素双靶点抗肿瘤药物，不仅具有高效低毒的特点，还通过导入特异的蛋白质多肽序列从而能发挥长效作用，代表着新一代基因工程肿瘤治疗药物的发展方向。
技术实现思路
人生长激素与人催乳素在多种人类肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。人生长激素与人催乳素通过结合与各自特异的受体，即人生长激素受体与人催乳素受体而发挥特异性的促进肿瘤恶性增殖与侵袭转移的作用。本专利技术根据人生长激素与人催乳素各自的受体在分子结构上高度的相似性，设计出能够竞争性地与人生长激素与人催乳素与各自受体结合的重组蛋白分子，从而达到特异性地同时阻断人生长激素受体与人催乳素受体激活的效果，以阻断人生长激素与人催乳素促进肿瘤恶性增殖的能力。为了提高本药物在体内对肿瘤的杀伤效率，我们还在其羧基端(C末端)插入了两个拷贝的人绒毛膜促性腺激素(hCGB)的羧基端肽段(CTP)，以提高其在体内的稳定性并延长药物的半衰期，从而构建得到0C001多肽。我们将编码0C001的表达载体pIRES-neo转染入中国仓鼠CHO细胞进行瞬时表达可以在细胞培养的上清中检测到重组蛋白多肽0C001的表达。我们将编码0C001的表达载体pIRES-neo分别转染转染入人乳腺癌细胞(及SKBR3及BT-474)及肝癌细胞(Bel-7404)，发现表达此蛋白都可以显著抑制这三种细胞的增殖。在CH0-DG44细胞中真核表达0C001并得到纯化后的蛋白，在体外有显著地抑制乳腺癌细胞、前列腺癌细胞和子宫内膜癌细胞生长激素信号功能和肿瘤细胞增殖的能力，药代学分析表明0C001在小鼠体内的代谢速率较生长激素显著降低，半衰期明显延长，表明0C001具有抑制肿瘤细胞增殖的良好活性和显著的长效性。【专利附图】【附图说明】图1是免疫印迹检测CHO细胞上清中的0C001表达。图2是在人肝癌细胞系Bel-7404和乳腺癌细胞系BT-474和SKBR3中转染0C001表达载体后的活力，可见过表达0C001显著抑制了癌细胞的活力。图3是ELISA检测稳定表达0C001的CH0-DG44单克隆细胞上清，可见第5号克隆的表达量相对较高。图4是SDS-PAGE检测经纯化后的0C001重组蛋白。图5是检测0C001重组蛋白对人乳腺癌细胞T47D生长激素信号的抑制作用，用免疫印迹来检测0C001对STAT5信号的抑制作用，可见在T47D细胞中，0C001可以显著抑制生长激素对STAT5的激活。图6是检测0C001重组蛋白对人前列腺癌细胞LnCAP生长激素信号的抑制作用，用免疫印迹来检测0C001对STAT5信号的抑制作用，可见在LnCAP细胞中，0C001可以显著抑制生长激素对STAT5的激活。图7是检测0C001重组蛋白对人子宫内膜癌细胞RL95-2生长激素信号的抑制作用，用免疫印迹来检测0C001对STAT5信号的抑制作用，可见在RL95-2细胞中，0C001可以显著抑制生长激素对STAT5的激活。图8是检测0C001蛋白对人乳腺癌细胞T47D的生长抑制作用，可见在低浓度血清下0C001显著地抑制T47D细胞的活力。图9是检测0C001蛋白对人子宫内膜癌细胞RL95-2的生长抑制作用，可见在低浓度血清下0C001显著地抑制RL95-2细胞的活力。图10是皮下注射0C001后检测小鼠血清中的蛋白含量，可见0C001的半衰期显著长于生长激素，显示其具有潜在的长效性。【具体实施方式】以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。1.人生长激素基因(cDNA)的克隆用Trizol法抽提人乳腺癌细胞系MCF7_hGH的总RNA，此细胞系是新加坡国立大学Peter Lobie教授所用于科研及发表论文的细胞系。采用Fermentas公司的RevertAidFirst strand cDNA合成试剂盒(产品目录号:K1622)将总RNA逆转录为cDNA。设计引物用于扩增人生长激素(GH)基因，所使用的引物序列如下:5’TTTAGCTAGCATGGCTACAGGCTCCCG3’ (SEQ ID NO:3)5’ACGAATTCCTAGAAGCCACAGCTGCC3’ (SEQ ID NO:4)采用Takara公司PrimerSTAR DNA聚合酶(产品目录号:DR044A)进行PCR反应，条件如下:98 0C 10 秒60 °C 5 秒72°C 50 秒共30个循环PCR产物经过纯化后(美国Axygen公司)，用Nhe I和EcoR I两种限制性内切酶(美国Fermentas公司)双酶切后，再经纯化，然后与酶切纯化后的载体pIRES-neo3(Clontech公司)进行连接反应(Takara公司)。转化细菌后，挑取单菌落，小量扩大培养，抽提质粒，再用酶切鉴定得到初步正确的克隆，再进行核酸测序得到证实。2.将人生长激素第120位的甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)米用重叠延伸PCR(Overlap extension PCR)将人生长激素第120位的甘氨酸(G)突变成精氨酸(R)，设计四条引物分别如下:A:5’TTTAGCTAGCATGGCTACAGGCTCCCG3’ (SEQ ID NO:5)B:5’GCGTTTGGATCCTTTCCTCTAGG3’ (SEQ ID NO:6)C:5，CCTAGAGGAAAGGATCCAAACGC3，(SEQ ID NO:7)D:5’ACGAATTCCTAGAAGCCACAGCTGCC3’ (SEQ ID NO:8)用以上克隆成功的pIRES-hGH质粒为模板，用A，B为引物，克隆出片段AB，PCR反应条件如下:98 0C 10 秒60 0C 5 秒72 0C 30 秒共30个循环同样以pIRES-hGH质粒为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组多肽，其特征在于该重组多肽通过以下方式构建得到：将人生长激素第120位的甘氨酸突变为精氨酸，并在其C端与两个拷贝的人绒毛膜促性腺激素基因β亚基C末端肽段融合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱涛，彼得洛比，
申请(专利权)人：武汉龙科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：