一种CD3抗原及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种CD3抗原及其制备方法和用途，其中，所述抗原包括：2个相同的连接肽，异亮氨酸拉链结构，CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E?ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D?ECD或者CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G?ECD；其中，所述2个相同的连接肽之间能够形成二硫键，所述异亮氨酸拉链结构由多肽链LZ1和多肽链LZ2形成；其中，所述抗原为由两个融合蛋白通过异亮氨酸氨酸拉链结构所形成的异二聚体，在第一个融合蛋白中，CD3E?ECD的C端通过一个连接肽连接在多肽链LZ1的N端，构成融合蛋白CD3E?ECD-LZ1，在第二个融合蛋白中，CD3D?ECD的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白CD3D?ECD-LZ2或者CD3G?ECD的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白CD3G?ECD-LZ2。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种CD3抗原及其制备方法和用途，其中，所述抗原包括：2个相同的连接肽，异亮氨酸拉链结构，CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E?ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D?ECD或者CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G?ECD；其中，所述2个相同的连接肽之间能够形成二硫键，所述异亮氨酸拉链结构由多肽链LZ1和多肽链LZ2形成；其中，所述抗原为由两个融合蛋白通过异亮氨酸氨酸拉链结构所形成的异二聚体，在第一个融合蛋白中，CD3E?ECD的C端通过一个连接肽连接在多肽链LZ1的N端，构成融合蛋白CD3E?ECD-LZ1，在第二个融合蛋白中，CD3D?ECD的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白CD3D?ECD-LZ2或者CD3G?ECD的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白CD3G?ECD-LZ2。【专利说明】一种CD3抗原及其制备方法和用途
本专利技术涉及一种⑶3抗原及其制备方法和在抗⑶3抗体的研究中的用途。
技术介绍
⑶3是人免疫T细胞表面标记抗原,是由四种亚基(subunit)组成的六聚体,通过电荷吸附作用围绕在T细胞受体(T cell rec印tor，TCR)周围。⑶3的四种亚基分别为⑶3 ε (⑶3Ε)、⑶3δ (⑶3D)、⑶3gamma (⑶3G)和⑶3 ζ (⑶3Ζ)，均为跨膜蛋白；并且⑶3Ε与⑶3D形成的二聚体、⑶3Ε与⑶3G形成的二聚体，通常可以作为抗⑶3抗体的识别靶位点。CD3E ECD 为 CD3E 的胞外结构域(extra-cellular domain), CD3D ECD 为 CD3D 的胞外结构域，⑶3G E⑶为⑶3G的胞外结构域。0KT3为一个商业化的抗⑶3抗体，其靶点为⑶3E和⑶3G的二聚体的胞外区。0KT3不仅能够结合⑶3，还具有激活T细胞的作用。有研究发现，只有当⑶3E和⑶3G形成了二聚体时才具有免疫原性，从而能被0KT3结合，而单独的CD3E或CD3G均无法被0KT3结合。UCHTl是一个常用的抗⑶3抗体，既能够识别⑶3E和⑶3D的二聚体的胞外结构域，也能识别⑶3E和⑶3G的二聚体的胞外结构域，而单独的⑶3E、⑶3D和⑶3G胞外结构域均无法被UCHTl识别。目前CD3抗原的制备方法有将CD3E ECD与CD3G ECD融合(CD3E-G ECD fusion);将 CD3E ECD 与 CD3D ECD 融合(CD3E-D ECD fusion)、将 CD3E、CD3G 和 CE3D 三种亚基的 ECD与Fe片段融合(CD3E/G/D-Fc);或者在融合蛋白的C端添加Flag标签(CD3E/G/D-Fc_Flag)或His标签(CD3E/G/D-Fc-His)等。CD3E-G ECD融合蛋白和CD3E-D ECD融合蛋白都采用原核表达，存在于包涵体中，纯化后需要进行复性，也有将⑶3E/G/D E⑶分别用原核表达，纯化后将⑶3E和⑶3G或⑶3D等比例混合进行复性AD3E/G/D-FC重组融合蛋白在293细胞中表达，具有免疫原性，能够被0KT3和UCHTl识别。原核表达CD3抗原虽然产量高，但是需要进行复性步骤，最后能够得到的具有免疫原性的CD3只有最初产量的10%甚至更低；真核表达CD3E/G/D-Fc重组融合蛋白，也存在有 CD3E-Fc、CD3D-Fc 和 CD3G_Fc 同源二聚体(homodimer)以及 CD3D-Fc-CD3G_Fc 异二聚体等杂质蛋白。而采用在不同的Fe的C端带不同的标签，虽然在一定程度上提高了最后得到的异二聚体纯度，但是纯化过程中，需要进行至少三步亲和层析，损失也比较多。另外，抗原的Fe标签对于筛选同源的抗体存在很大的局限性，会产生很强的背景干扰。这种干扰同样也会影响到ELISA的实验结果。另外，使用带FC标签的抗原进行抗体筛选时，会出现特异针对标签很高亲和力的抗体，标签越长，出现此类抗体的比例越大，这对筛选结合⑶3抗原的抗体产生一定的干扰。由于目前⑶3抗原及其制备方法中存在的上述缺点，有必要开发一种能够使⑶3E和⑶3D、⑶3E和⑶3G分别形成异二聚体的携带有非Fe片段蛋白标签的通过真核表达系统制备的新的CD3抗原及其制备方法。
技术实现思路
为此，本专利技术提出了一种可以解决上述问题的或至少能部分解决上述问题的一种⑶3抗原，其中，所述抗原包括:2个相同的连接肽，异亮氨酸拉链结构，⑶3的ε亚基⑶3Ε的胞外结构域⑶3Ε E⑶，以及⑶3的δ亚基⑶3D的胞外结构域⑶3D E⑶或者⑶3的Y亚基⑶3G的胞外结构域⑶3G E⑶；其中，所述2个相同的连接肽之间能够形成二硫键，所述异亮氨酸拉链结构由多肽链LZl和多肽链LZ2形成；其中，所述抗原为由两个融合蛋白通过异亮氨酸氨酸拉链结构所形成的异二聚体，在第一个融合蛋白中，⑶3Ε E⑶的C端通过一个连接肽连接在多肽链LZl的N端，构成融合蛋白⑶3Ε E⑶-LZ1，在第二个融合蛋白中，⑶3D E⑶的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白⑶3D E⑶-LZ2或者⑶3G E⑶的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白⑶3G E⑶-LZ2。其中，在所述融合蛋白中，多肽链LZl和多肽链LZ2的C端分别连接有一个相同或不同的短肽标签；所述短肽标签选自由Flag、His、Myc和HA所组成的组中的一种或两种。本专利技术还提供了一种⑶3抗原的制备方法，所述方法包括:(I)分别构建重组载体e和重组载体d，或者分别构建重组载体e和重组载体g ；(2)在真核细胞中转染重组载体e和d，或者转染重组载体e和g ;(3)利用亲和层析方法纯化获得⑶3抗原⑶3E/⑶3D-LZ或者⑶3E/⑶3G-LZ ；其中，所述重组载体e含有融合蛋白⑶3E E⑶-LZI的编码核苷酸序列；所述重组载体g含有融合蛋白⑶3G E⑶-LZ2的编码核苷酸序列；所述重组载体d含有融合蛋白⑶3DE⑶-LZ2的编码核苷酸序列。本专利技术还提供了上述⑶3抗原在抗⑶3抗体的研究中的应用。本专利技术还提供了上述CD3抗原在抗原抗体相互作用研究中的应用。通过上述技术方案，本专利技术的⑶3抗原具有如下优点:(I)使用真核表达系统，不需要对蛋白进行复性；(2)使用短肽标签构建融合蛋白，简化了纯化步骤；(3)改造融合蛋白序列，使⑶3E和⑶3D、⑶3E和⑶3G能够分别形成异二聚体；(4)避免使用Fe标签，在进行抗体检测，如ELISA实验时减少背景干扰；(5)标签长度不超过70个氨基酸，在进行抗CD3抗体筛选时减少标签干扰；(6)与抗CD3的抗体0KT3，UCHT1，TRX4和L2K均能特异性结合；(7)所带的标签不同于各类IgG，可避免与各类二抗发生反应。本专利技术所制备的CD3抗原可以用于抗CD3抗体的筛选、鉴定、检测，以及亲和力测定。本专利技术的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。【专利附图】【附图说明】附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制，在附图中:图1为本专利技术所提供的⑶3抗原的结构示意图。图2为重组载体pcDNA3.1 (+) Hygro-CD3E本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CD3抗原，其特征在于所述抗原包括：2个相同的连接肽，异亮氨酸拉链结构，CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E?ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D?ECD或者CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G?ECD；其中，所述2个相同的连接肽之间能够形成二硫键，所述异亮氨酸拉链结构由多肽链LZ1和多肽链LZ2形成；其中，所述抗原为由两个融合蛋白通过异亮氨酸氨酸拉链结构所形成的异二聚体，在第一个融合蛋白中，CD3E?ECD的C端通过一个连接肽连接在多肽链LZ1的N端，构成融合蛋白CD3E?ECD?LZ1，在第二个融合蛋白中，CD3D?ECD的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白CD3D?ECD?LZ2或者CD3G?ECD的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白CD3G?ECD?LZ2。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张敬，王瑞，钟慧，李刚，周鹏飞，
申请(专利权)人：武汉友芝友生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：