【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及新的7β_羟基类固醇脱氢酶突变体，编码这些酶突变体的序列，制备酶突变体的方法及其在胆酸化合物的酶促反应，特别是在制备熊去氧胆酸(UDCA)中的用途；本专利技术也涉及使用酶突变体合成UDCA的新方法；和使用重组的，经多重修饰的微生物制备UDCA。专利技术背景:多年来，活性物质熊去氧胆酸(UDCA)及相关的非对映异构体鹅去氧胆酸(CDCA)特别用于胆石病的药物治疗。这2种化合物仅在7位碳原子上的羟基构型上不同(UDCA:β -构型，CDCA: α -构型)。现有技术已描述了多种制备UDCA的方法，其通过纯化学进行，或包含化学和酶促方法步骤的组合。在每种情况下起点是胆酸(CA)或从胆酸制备的CDCA。因此，制备UDCA的经典化学方法可图示如下:
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.12.16 EP 10015726.21.7 β -羟基类固醇脱氢酶(7 β -HSDH)突变体，所述突变体至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，其中突变体较之非突变的酶，具有特别是对7-酮类固醇底物的降低的底物抑制，和/或改变的辅因子利用。2.如权利要求1中要求保护的突变体，其中所述突变体在根据SEQID NO:2的氨基酸序列或从其衍生的具有至少60%序列同一性的氨基酸序列中有至少一个突变。3.7 β -羟基类固醇脱氢酶(7 β -HSDH)突变体，所述突变体至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，其中所述突变体在根据SEQ ID NO:2的第36至42位的序列基序VMVGRRE中或从其衍生的具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的对应的序列基序中有至少一个突变。4.如权利要求2或3中要求保护的突变体，所述突变体选自 a)单突变体GSgX1和R40X2 b)双突变体(G39X!，R40X2)，(R40X2,R41X3)和(G39X!，R41X3)或 c)三突变体(G39X1；R40X2, R41X3)， d)或从SEQID NO:2衍生的具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的对应的单、双或三突变体； 其中在每种情况下X1, X2和X3彼此独立地代表突变的氨基酸残基。5.重组微生物，其携带编码如前述权利要求之一中要求保护的突变体的至少一种核酸序列或至少一种对应的表达盒或至少一种对应的载体并另外任选地携带另一种酶的编码序列，所述另一种酶选自羟基类固醇脱氢酶，例如3 α -羟基类固醇脱氢酶(3 a -HSDH)，和适于辅因子再生的脱氢酶。6.用于7β -羟基类固醇的酶促或微生物合成的方法，其中在存在根据权利要求1至4之一中定义的7 β -HSDH突变体时或在存在表达此突变体的重组微生物时，使对应的7-酮类固醇起反应，且任选地从反应混合物中分离形成的至少一种还原产物。7.如权利要求6中要求保护的方法，其中所述还原在存在和特别是消耗NADPH和/或NADH时进行。8.如权利要求7中要求保护的方法，其中通过与NADPH再生酶偶联再生用过的NADPH，其中所述NADPH再生酶特别选自NADPH脱氢酶、醇脱氢酶(ADH)、和NADPH再生甲酸脱氢酶(FDH)和NADPH再生葡萄糖脱氢酶(⑶H)，其中所述NADPH再生酶任选地通过重组微生物表达；和/或其中通过与NADH再生酶偶联再生用过的NADH，其中所述NADH再生酶特别选自NADH脱氢酶、NADH再生甲酸脱氢酶(FDH)、NADH再生醇脱氢酶(ADH)、NADH再生葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6TOH)、NADH再生亚磷酸盐脱氢酶(PtDH)和NADH再生葡萄糖脱氢酶(⑶H)，其中所述NADH再生酶任选地在重组微生物中表达。9.如权利要求8中要求保护的方法，其中所述NADPH再生酶选自NAD+依赖性甲酸脱氢酶(FDH)(其至少催化甲酸酶促氧化至CO2)的突变体，其中所述突变体较之非突变的酶，额外地接受NADP+作为辅因子。10.如权利要求9中要求保护的方法，其中所述NADP+接受FDH突变体在根据SEQIDNO:36的来自母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)N10的FDH的氨基酸序列或从其衍生的具有至少60%序列同一性的氨基酸序列中有至少一个突变。11.如权利要求9和10之一中要求保护的方法，其中所述NADP+接受突变体在根据SEQID NO:36的第221至226位的序列基序TDRHRL中或在从其衍生的具有至少60%序列同一性的氨基酸序列的对应序列基序中有至少一个突变。12.核酸序列，其选自以下核酸序列: a洞时编码如权利要求9至11之一中要求保护的FDH突变体和如权利要求1至4之一中要求保护的7 β -HSDH突变体和任选地3 a -HSDH ;或 b)同时编码如权利要求9至11之一中要求保护的FD...
【专利技术属性】
技术研发人员：D·沃伊斯特博茨，M·布劳恩，A·艾格纳，B·孙，C·坎特佐，S·布莱施，D·巴孔伊，W·胡梅尔，
申请(专利权)人：细胞制药有限公司，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。