一种检测乙肝病毒核酸试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种检测乙肝病毒核酸试剂盒。该试剂盒包括样本处理液A，样本处理液B，内标，PCR反应液A，PCR反应液B，阴性质控品，阳性质控品，定量参考品等。该试剂盒PCR反应液A中包含一对寡核苷酸探针，其中荧光探针序列是：5′-FAM-ATCACCACCATCTGGTTTCACCCGGAC-P-3′，淬灭探针序列是：5′-GAAACCAGATGGTGGTGA-Dabcyl-3′，将此探针应用到荧光定量PCR的方法中对样本中的乙型肝炎病毒核酸进行定性定量检测,具有高灵敏度、高特异性、操作简单、检测速度快的特点。鉴于以上优势，上述试剂盒可广泛应用于乙型肝炎病毒感染的辅助诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于检测乙肝病毒核酸试剂盒。
技术介绍
乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致肝硬化和干细胞癌的主要原因之一。HBV感染者血浆（清）中HBV核酸是了解肝内HBV复制水平、HBV感染诊断、疗效监控和指导用药的重要指标，准确灵敏的定量检测血清中HBV核酸对乙型肝炎治疗效果的监测具有极其重要意义。目前，荧光定量PCR法检测HBV核酸现是检测乙肝病毒复制最常用的手段。尽管我国HBV核酸定量试剂质量得到很大改进，但多数试剂的灵敏度、准确度及重复性等与进口优质试剂相比，仍存在较大差距。国际主流HBV核酸定量试剂，如Roche定量试剂的检测下限为12～20IU/ml。而目前我国市场上主流的国产HBV核酸定量检测下限一般为500～1000IU/ml，不能满足临床诊断需求。
技术实现思路
针对上述不足，本专利技术的目的在于提供一种基于复合探针技术的实时荧光PCR技术检测乙型肝炎病毒核酸的试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一对寡核苷酸探针，其荧光探针序列是：5′-FAM-ATCACCACCATCTGGTTTCACCCGGAC-P-3′；淬灭探针序列是：5′-GAAACCAGATGGTGGTGA-Dabcyl-3′。本专利技术还提供了一种检测乙肝病毒核酸的试剂盒，该试剂盒包括含有上述寡核苷酸探针的PCR反应液A。上述PCR反应液A还包括用于监测体系的内标探针，该内标探针序列是：5′-HEX-TCCATTACACGTGAACGATTCCCCA-TAMRA-3′。上述PCR反应液A还包括含有Mg2+，dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP，甲酰胺，Tris-HCl，KCl，Tween20的PCR反应缓冲液；靶基因正向引物、反向引物；内标的正向引物、反向引物。其中，所述PCR反应液中的靶基因扩增的引物的是：正向引物5′-CGTCTCGAGCAACTATACTGT-3′反向引物5′-CACCGGTCGTGCACAGTATC-3′。其中，所述监测体系的内标引物是：正向引物5′-GCCTTTCATTGGCATGACCACCTTTCAT-3′反向引物5′-AGCCAGTCGTCATAATCGCATT-3′。上述用于检测乙型肝炎病毒核酸的试剂盒还包括样本处理液A，样本处理液B，内标，PCR反应液B，阴性质控品，阳性质控品，定量参考品。其中，所述样品处理液A是7%PEG6000；样品处理液B包含NaOH，TritonX-100，NP40，Tris-HCL；PCR反应液B包含Taq酶和UNG酶；阴性质控品是正常血清；阳性质控品是含HBV核酸的重组DNA片段；定量参考品是含HBV核酸的重组DNA片段；内标质控品是含荧光素酶的重组DNA片段。本专利技术的另一个目的是上述试剂盒在快速检测乙型肝炎病毒上的应用。上述应用，包括下列步骤：1）用样本处理液A和B进行阴、阳性质控品以及利用磁珠法分离待测样本的DNA。2）将提取的DNA加入到含有PCR反应液A和PCR反应液B的PCR反应管中，进行PCR扩增，使用荧光定量PCR检测仪进行检测。本专利技术与现有技术相比，具有下列优点：1）高灵敏度，最低检测浓度为50IU/ml；2）全封闭反应，提取病毒DNA后，直接用于PCR检测，避免了污染发生；3）检测速度快，整个过程不超过2小时；4）操作简单，可控性强，可进行大批量样品检测，有利于产业化；5）PCR反应体系中加有内标，具有防止假阴性等优点。6）加有防污染体系，具有防止产物污染的作用。可见，该试剂盒通过对样本中的乙型肝炎病毒核酸进行定性定量检测,由于其具有高灵敏度、高特异性、操作简单、检测速度快的特点，可广泛应用于乙型肝炎病毒感染的辅助诊断。附图说明图1是显示工作标准品扩增曲线。其中，（1）是各标准品扩增曲线，（2）是各标准品线性相关关系图。图2是显示阴性质控品品质鉴定图。其中，（1）说明检测过程中没有乙型肝炎病毒核酸的污染,实验过程能正常扩增，（2）内标质控品扩增曲线，说明检测体系有效扩增。图3是显示阳性质控品扩增曲线。图示扩增曲线为S型曲线，说明检测体系有效扩增了乙型肝炎病毒核酸。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的前提下，对本专利技术所作的修饰或者替换，均属于本专利技术的范畴。实施例1：一种检测乙肝病毒核酸试剂盒的组装本专利技术的试剂盒由以下部分组成：样本处理液A，样本处理液B，内标，PCR反应液A，PCR反应液B，阴性质控品，阳性质控品，定量参考品。上述试剂盒各部分的组分与配比如下：样品处理液A：7%PEG6000。样品处理液B：含有NaOH，TritonX-100，NP40，1MTris-HCL(PH8.0)。PCR反应液A：含有Mg2+，dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP，甲酰胺，Tris-HCl，KCl，Tween20的PCR反应缓冲液；靶基因和内标的正向引物、反向引物；寡核苷酸探针和内标探针、灭菌水。PCR反应液B：包含Taq酶和UNG酶；阴性质控品：正常血清；阳性质控品：含HBV脱氧核糖核酸的重组DNA片段；定量参考品：含HBV脱氧核糖核酸的重组DNA片段；内标质控品：含荧光素酶的重组DNA片段。该试剂盒，上述组分的量为：样品处理液A：5.0mlx2管；样品处理液B：1.3mlx2管；PCR反应液A：1.4mlx1管；PCR反应液B：60ulx1管；阴性质控品：400ulx1管；阳性质控品：400ulx1管；①～④定量参考品：各400ulx1管；内标质控品：100ulx1管。实施例2：一种检测乙肝病毒核酸试剂盒方法的建立1、样本采集本试剂盒适用于血清或血浆样本。采集血清：取受检者静脉血2ml，收集于无菌离心管中，室温放置不超过4小时，3000rpm离心20分钟，吸取血清转入另一无菌离心管中备用；采集血浆：取受检者静脉血2ml于含有抗凝剂的无菌离心管中（禁止使用肝素抗凝），室温放置不超过4小时，3000rpm离心20分钟，分离血浆，转入无菌离心管备用。2、核酸提取1）取阴性对照加入到样品处理液A中，加入比例为1：49，按需加入；取阳性对照加入到样品处理液A中，加入比例为1：49，按需加入；取定量参考品加入到样品处理液A中，加入比例为1：49，按需加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一对寡核苷酸探针，其特征在于，荧光探针序列是：5′?FAM?ATCACCACCATCTGGTTTCACCCGGAC?P?3′；淬灭探针序列是：5′?GAAACCAGATGGTGGTGA?Dabcyl?3′。

【技术特征摘要】
1.一对寡核苷酸探针，其特征在于，荧光探针序列是：5′-FAM-
ATCACCACCATCTGGTTTCACCCGGAC-P-3′；淬灭探针序列是：
5′-GAAACCAGATGGTGGTGA-Dabcyl-3′。
2.含有权利要求1所述的寡核苷酸探针的检测试剂。
3.一种检测乙肝病毒核酸试剂盒，其特征在于，包括含有权利要求1所述的
寡核苷酸探针的PCR反应液A。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，上述PCR反应液A还包括用
于监测体系的内标探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，上述内标探针序列是：5′-HEX-
TCCATTACACGTGAACGATTCCCCA-TAMRA-3′。
6.根据权利要求3～5任一项所述的试剂盒，其特征在于，上述PCR反应液
A还包括含有Mg2+，dATP，dCTP，dGTP，dTTP，dUTP，甲酰胺，Tris-HCl，KCl，
Tween-20的PCR反应缓冲液；靶基因正向引物、反向引物；内标的正向引物、
反向引物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩勇军，刘琪琦，林晓云，李洪强，李洪生，
申请(专利权)人：北京普利耐特生物科技有限公司，中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所，
类型：发明
国别省市：