本发明专利技术公开了一种跨膜输出蛋白基因选择克隆T载体及其应用。T载体，通过如下方法构建：将阿拉伯糖启动子插入pMBL载体中β-内酰胺酶基因的上游，得到重组克隆载体；在所述重组克隆载体的β-内酰胺酶基因与启动子之间引入两个Xcm?I酶切位点，得到前T载体；限制性内切酶Xcm?I酶切所述的前T载体，回收线性化载体，得到所述的T载体。本发明专利技术还公开了所述T载体在体外筛选跨膜输出蛋白基因中的应用。本发明专利技术的T载体，相容性好，连接效率高，能够以直接克隆随机PCR产物的方式选择性地克隆和筛选含有信号肽序列的跨膜输出蛋白基因，且进行筛选跨膜输出蛋白基因时，只需构建一个基因文库，操作便捷、成本低。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种跨膜输出蛋白基因选择克隆T载体及其应用。T载体，通过如下方法构建：将阿拉伯糖启动子插入pMBL载体中β-内酰胺酶基因的上游，得到重组克隆载体；在所述重组克隆载体的β-内酰胺酶基因与启动子之间引入两个Xcm?I酶切位点，得到前T载体；限制性内切酶Xcm?I酶切所述的前T载体，回收线性化载体，得到所述的T载体。本专利技术还公开了所述T载体在体外筛选跨膜输出蛋白基因中的应用。本专利技术的T载体，相容性好，连接效率高，能够以直接克隆随机PCR产物的方式选择性地克隆和筛选含有信号肽序列的跨膜输出蛋白基因，且进行筛选跨膜输出蛋白基因时，只需构建一个基因文库，操作便捷、成本低。【专利说明】一种跨膜输出蛋白基因选择克隆T载体及其应用
本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种跨膜输出蛋白基因选择克隆T载体及其应用。
技术介绍
在细菌中，细菌外膜蛋白和分泌至胞外的分泌蛋白合称跨膜输出蛋白(exportedprotein)，编码这些蛋白的基因占到全部基因的20%至30%。跨膜输出蛋白包括为适应体内缺铁环境而表达的转铁膜蛋白、细菌的外毒素、多杀性巴氏杆菌的交叉保护因子等，在细菌的侵袭力和产毒素能力、以及人和动物机体对病原菌的识别和免疫应答等方面都起着重要的作用，对它们的深入研究可以为人类和畜禽细菌性传染病的预防和控制提供线索。大部分跨膜输出蛋白的跨膜分泌是由其前蛋白(pr印rotein) N-末端的信号肽驱动，这些跨膜输出蛋白约占细菌编码基因组的17%。信号肽往往由带正电的氨基端结构域(η-区域)、中间的疏水跨膜区(h-区域)和极性的羧基端结构域(C-区域)三部分组成，并含有信号肽切除的位点。这些特点为计算机自动化分析预测蛋白提供了理论依据，并开发出了许多预测软件。如基于神经网络(neural networks, NN)方法、隐马科夫模型(hiddenMarkov models,HMM)方法开发的软件SignalP是预测信号肽和剪切位点较有效的方法，其准确性也结合实验方法进行了验证。目前对病原菌跨膜输出蛋白的实验研究主要采用常规的蛋白提取、SDS-PAGE电泳、单克隆抗体制备、Western blot以及双向电泳和蛋白质序列质谱分析等蛋白质组学方法，操作相对费时费力。余旭平，朱军莉，姚雪萍等提供了利用DNA的可扩增性，应用缺失信号肽和启动子的内酰胺酶基因作为报告子，构 建跨膜输出蛋白基因选择克隆载体PMBL (余旭平，朱军莉，姚雪萍等，“捕获输出蛋白编码基因的小分子量质粒载体的构建与验证”。浙江大学学报，2004，30 (2):127~132.)。该pMBL载体用无启动子和信号肽序列的β-内酰胺酶(可分解氨苄青霉素(Amp))基因作为报告基因，当外源跨膜蛋白基因被克隆入β-内酰胺酶基因上游时，跨膜蛋白所携带的信号肽会驱动跨膜蛋白和β_内酰胺酶共同表达分泌到菌体胞外，这样分泌到胞外的内酰胺酶可降解培养基中的Amp，使细菌能够在Amp平板上生长。而不含信号肽序列的基因被克隆入内酰胺酶基因上游时，由于无信号肽，不能驱动β-内酰胺酶向胞外分泌，细菌就不能抵抗Amp，不能在Amp平板上生长。因此，通过利用该载体，通过常规的酶切、连接等分子生物学手段即可实现跨膜输出蛋白基因的鉴定，大大简化了操作。尽管如此，上述载体仍然存在一定的缺陷，如:该载体pMBL能够有效地克隆含启动子和信号肽序列的基因，但是对于无启动子或者体内特殊信号诱导表达的跨膜输出蛋白基因无能为力。其次，在构建文库对细菌的跨膜输出蛋白基因进行系统研究时，采用pMBL载体需要构建三个文库才能全部覆盖基因组的所有基因。pMBL载体带有三个酶切位点(BamH I，Bcl I，Bgl II )，该三位点分别以三种不同的阅读框对应于下游的内酰胺酶报告基因，而这三种酶与Mob I (或Sau3AI)均可产生相同的粘性末端即GATC。在采用pMBL载体进行基因组文库构建时，需要将基因组DNA用Mob I (或Sau3AI)部分酶切制备随机片段，而Mob I (或Sau3AI)位点在基因组DNA中的位置是固定的，Mob I (或Sau3AI)酶切后会产生三种不同阅读框架的的随机DNA片段，为了使DNA片段中这些不同阅读框架的基因均能与下游的β-内酰胺酶报告基因对位融合，只能用BamH I1Bcl I，Bgl II酶切pMBL质粒上位于不同阅读框的三种位点，制备三种载体，构建三个不同阅读框的文库，工作量大；另外，载体酶切后，为防载体自连，需要进行脱磷，而脱磷会导致载体连接效率低下。。
技术实现思路
为克服上述缺陷，本专利技术提供了一种T载体，与宿主菌的相容性好，连接效率高，能够以直接克隆随机PCR产物的方式选择性地克隆和筛选含有信号肽序列的跨膜输出蛋白基因，无论该跨膜输出蛋白基因是否带有活性启动子，且进行筛选跨膜输出蛋白基因时，只需构建一个基因文库，操作便捷、成本低。一种T载体，通过如下方法构建:(I)将阿拉伯糖启动子插入pMBL载体中β-内酰胺酶基因的上游，得到重组克隆载体；(2)在所述重组克隆载体的内酰胺酶基因与启动子之间引入两个Xcm I酶切位点，得到前T载体；(3)限制性内切酶Xcm I酶切所述的前T载体，回收线性化载体，得到所述的T载体。所述pMBL载体即为“捕获输出蛋白编码基因的小分子量质粒载体的构建与验证”(余旭平，朱军莉，姚雪萍等，浙江大学学报，2004，30 (2): 127~132.)或“跨膜蛋白基因克隆载体PMBL的构建及验证”(余旭平，朱军莉，姚雪萍等，遗传学报，2003，30 (8):730~736)中所提及的pMBL载体。所述的阿拉伯糖启动子来源于大肠杆菌(E.coli)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。阿拉伯糖启动子来自大肠杆菌的阿拉伯糖操纵子，而该操纵子由调苄基因(araC:调控蛋白)、操纵基因(araOl, ara02和aral)、结构基因(araB、araA和araD:编码与阿拉伯糖利用有关的三种酶)、启动基因(Pc:启动araC基因转录、PBAD:启动araB、araA和araD基因转录)组成。阿拉伯糖代谢是由araB、araA和araD三个结构基因所编码的三种酶催化的。阿拉伯糖操纵子调节三个结构基因的表达，其特点是:(I)操纵子中有两个启动子=Pc和PBAD，可以双向转录；Pc启动子负责调节蛋白C的表达，Pc启动子和araOl重叠，而PBAD负责三个结构基因的表达；(2)AraC蛋白是双功能的，单纯的C蛋白结于araOl，起到阻遏的作用；当C蛋白和诱导物阿拉伯糖(Ara)结合形成的复合体Cind (即诱导型的C蛋白)，它转而结合于aral区使RNA聚合酶结合于PBAD位点，转录B、A、D三个基因；(:蛋白结合araOl时也反馈性地阻遏了其本身的表达。当葡萄糖(Glu)和阿拉伯糖(Ara)都存在时，C本底转录，产生少量的C蛋白，结合于araOl,使RNA聚合酶不能结合Pc启动基因，使araC的转录受到阻遏。当有Ara存在，而没有Glu时，Ara可作为糖源。此时Ara和少量的C蛋白结合形成了诱导型的C蛋白一Cind，它作为正调控因子结合于aral，促进了 PBAD启动基因的转录功能，产生了 B、A、D3种酶，促使本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种T载体，其特征在于，通过如下方法构建：（1）将阿拉伯糖启动子插入pMBL载体中β?内酰胺酶基因的上游，得到重组克隆载体；（2）在所述重组克隆载体的β?内酰胺酶基因与启动子之间引入两个Xcm?I酶切位点，得到前T载体；（3）限制性内切酶Xcm?I酶切所述的前T载体，回收线性化载体，得到所述的T载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余旭平，朱军莉，刘江梅，牛冬，沈琴芳，姚学萍，袁佳杰，谭双，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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