本发明专利技术公开了一种重组Sushi多肽的表达质粒体系、其构建方法及应用。作为本发明专利技术技术方案的典型实施方案之一，其可以包括：利用蛋白质体外剪切系统，在特定位点断开鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段，分别连接到断裂蛋白质内含子的N端片段(IN)和C端片段(IC)在大肠杆菌中表达，表达产物经纯化，复性以及内毒素去除后，体外诱导该蛋白质内含子发生剪切，得到C因子中CES12片段，即，具有内毒素结合活性的重组Sushi多肽。本发明专利技术能够实现鲎C因子中具有内毒素结合活性的功能片段的快速、大量以及低成本表达，并可有效避免宿主细胞中所含LPS的影响，有利于低成本内毒素检测试剂的规模化生产和应用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种重组Sushi多肽的表达质粒体系、其构建方法及应用。作为本专利技术技术方案的典型实施方案之一，其可以包括：利用蛋白质体外剪切系统，在特定位点断开鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段，分别连接到断裂蛋白质内含子的N端片段(IN)和C端片段(IC)在大肠杆菌中表达，表达产物经纯化，复性以及内毒素去除后，体外诱导该蛋白质内含子发生剪切，得到C因子中CES12片段，即，具有内毒素结合活性的重组Sushi多肽。本专利技术能够实现鲎C因子中具有内毒素结合活性的功能片段的快速、大量以及低成本表达，并可有效避免宿主细胞中所含LPS的影响，有利于低成本内毒素检测试剂的规模化生产和应用。【专利说明】重组Sushi多肽的表达质粒体系、其构建方法及应用
本专利技术涉及一种重组多肽，尤其涉及一种重组Sushi多肽的制备方法。
技术介绍
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外层上特有的结构，其化学成分为脂多糖(LPS)。细菌内毒素可引起人体发热、休克甚至死亡，但它又普遍存在且不易灭活，因而在制药和医疗器械制造中内毒素检测尤为重要。此外，内毒素检测也可以用于临床上相关疾病的诊断和预防。鳖试剂是国际上至今为止检测内毒素最常用的试剂，然而鲎数量有限以及鲎试剂批次间不均一性等局限性，迫切需要开发鲎试剂的替代品。研究表明，鲎C因子(FactorC)是鲎试剂中对内毒素具有高亲和力的丝氨酸蛋白酶原，且其N端的3个Sushi结构域是LPS的主要结合部位。Ding利用昆虫表达系统生产重组Factor C用于内毒素检测，并合成Sushi3区域中与LPS结合的34个氨基酸的多肽，可用于内毒素中和与检测。王东宁等利用大肠杆菌表达了 Factor C，并证实重组蛋白对LPS有中和活性。尽管大肠杆菌表达重组蛋白具有快速、大量以及低成本等优点，但是由于大肠杆菌中含有LPS，严重限制了该种重组蛋白的大批量生产与应用。
技术实现思路
针对现有技术中的不足，本专利技术的目的在于提供一种重组Sushi多肽的表达质粒体系、其构建方法及其在制备重组Sushi多肽中的应用。为实现上述专利技术目的.，本专利技术采用了如下技术方案:一种重组Sushi多肽的表达质粒体系，包含分别与断裂蛋白质内含子的N端片段和C端片段连接的第一基因和第二基因，其中，所述第一基因和第二基因由用于编码鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因在选定位点断裂而形成。作为较为优选的实施方案之一，所述用于编码鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因包括用于编码sushil和/或sushi3区域的基因。进一步的，所述选定位点可选自对应于鲎C因子序列的第492和第493个核苷酸之间的位置。如上所述重组Sushi多肽的表达质粒体系的构建方法，包括:(I)提供第一选定载体，并将鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的基因序列克隆到所述第一选定载体上，再将断裂蛋白质内含子插入所述基因序列的选定位点，获得第一质粒；(2)以第一质粒为模板，经PCR获得N片段，以及，Pst I和Nde I分步酶切第一质粒，获得C片段；(3)另取第一选定载体，并将所述N片段和所述C片段分别克隆到第一选定载体上，而后Pst I和Nde I双酶切分别连接到第二选定载体上，得到两种目标表达质粒。其中，所述第一选定载体包括PTA2载体，所述第二选定载体包括pTWINl载体，但均不限于此。作为较佳的应用方案之一，该构建方法可以具体包括:(I)将鲎C因子的CES12的编码基因序列TA克隆到PTA2载体上；将断裂蛋白质内含子插入所述CES12的编码基因序列的选定位点，得到质粒PTA2/his-DnaX-CESI2；(2)以所述质粒pTA2/his-DnaX_CES12作为模板，经PCR得到N端片段，以及，PstI和Nde I分步酶切pTA2/hi s-DnaX-CES 12获得C端片段；(3)将N、C端片段分别经TA克隆到PTA2载体，并Pst I和Nde I双酶切分别连接到pTWINl载体上，获得目标表达质粒pTWINl/his-DnaX-CES12-N和pTWINl/his-DnaX-CESI2-Cο如上所述重组Sushi多肽的表达质粒体系在制备重组Sushi多肽中的应用。一种宿主细胞，包含如上所述的重组Sushi多肽的表达质粒体系。一种重组Sushi多肽的制备方法，包括:将如上所述重组Sushi多肽的表达质粒体系于宿主细胞中进行融合表达，获得N端前体蛋白和C端前体蛋白，而后依次经纯化和去内毒素后，再诱导断裂蛋白质内含子剪接反应，获得具有LPS中和活性的目标产物。作为较佳的应用方案之一，所述N端前体蛋白包含鲎C因子的CES12的N端部分和Ssp DnaX的N端部分及与其直接相连的His6组氨酸标签,所述C端前体蛋白包含SspDnaX的C端部分及与其直接相连的His6标签和CES12的C端部分。本专利技术系采用了 蛋白质反式剪接技术而实现的，S卩，利用断裂蛋白质内含子N端片段(IN)和C端片段(IC)的相互识别和结合，在IN和IC紧密结合的状态下，使断裂蛋白质内含子正确折叠而重建活性中心，释放断裂蛋白质内含子，连接蛋白质外显子，进而实现将一个蛋白质分两段表达后再剪接起来形成完整的蛋白质。作为本专利技术的一个典型实施方案之一,可以通过Overlap extension PCR技术在特定位点断开CES12基因(鲎C因子的Cys-rich、EGF-1ike和SushiU Sushi2区)，并分别连接到断裂蛋白质内含子Ssp DnaX的N端片段(IN)和C端片段(IC)进行融合表达、纯化和去内毒素后，诱导内含子剪接反应，得到了有LPS中和活性的目标蛋白。需要指出的是，前述断裂蛋白质内含子可选自但不限于Ssp DnaX等。前述鲎C因子可来源于美洲鲎、东方鲎、南方鲎或圆尾鲎等。与现有技术相比，本专利技术的优点至少在于:能够实现鲎C因子中具有内毒素结合活性的功能片段(重组Sushi蛋白)的快速、大量以及低成本表达，并可有效避免宿主细胞中所含LPS的影响，有利于低成本内毒素检测试剂的规模化生产和应用。【专利附图】【附图说明】图1是本专利技术一较佳实施方案中鲎C因子功能片段CES12的反式剪接合成流程图，其中，a为N端如体蛋白，b为C端如体蛋白，c为目标蛋白；图 2 是 pTWINl/his-DnaX-CES12-N 和 pTWINl/his-DnaX-CES12_C 构建图；图3是酶切鉴定质粒的Agarose Gel电泳图，其中，1-对照质粒；2_BamHI 酶切 pTA2/his-DnaX-CES12，得到 400bp 的正确条带；3_Pst I/Nde I 双酶切pTWINl/his-DnaX-CES12-N 得到 800bp 的正确条带；4-Pst I/Nde I 双酶切 pTWINl/hi s-DnaX-CES 12-C 得到 387bp 的正确条带。图 4 是 Hi s-DnaX-CES 12-N 和 Hi s-DnaX-CES 12-C 融合蛋白的表达的 SDS-PAGE 图，其中，1，未诱导菌液沉淀；2，N端蛋白菌液上清(25°C诱导)；3，N端蛋白菌液沉淀(25°C诱导)；4，N端蛋白菌液上清(37°C诱导)；5，N端蛋白菌液沉淀(37°C诱导)；6，C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组Sushi多肽的表达质粒体系，其特征在于，包含分别与断裂蛋白质内含子的N端片段和C端片段连接的第一基因和第二基因，其中，所述第一基因和第二基因由鲎C因子中能与内毒素结合的功能片段的编码基因序列在选定位点断裂而形成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张春，王影影，齐兴梅，刘涛，祁静，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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