一种改良共变性荧光原位杂交方法技术

本发明专利技术涉及一种荧光原位杂交技术，公开了一种改良共变性荧光原位杂交方法，包括制备玻片标本、探针与染色体共变性和杂交、杂交后洗涤并染色和信号检测。本发明专利技术在现有技术的基础上，采用探针与染色体共变性和杂交的方法，操作简单，缩减了反应步骤，缩短了实验时间，且不需要使用有毒致畸的变性剂，降低了实验成本，避免了变性剂对实验操作人员和环境的危害，提供了一种定位准确、灵敏度高、实验效率高，稳定性好，操作简单，环境友好的改良共变性荧光原位杂交方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种荧光原位杂交技术，公开了，包括制备玻片标本、探针与染色体共变性和杂交、杂交后洗涤并染色和信号检测。本专利技术在现有技术的基础上，采用探针与染色体共变性和杂交的方法，操作简单，缩减了反应步骤，缩短了实验时间，且不需要使用有毒致畸的变性剂，降低了实验成本，避免了变性剂对实验操作人员和环境的危害，提供了一种定位准确、灵敏度高、实验效率高，稳定性好，操作简单，环境友好的改良共变性荧光原位杂交方法。【专利说明】
本专利技术涉及一种荧光原位杂交技术，尤其涉及了。
技术介绍
突光原位杂交(Fluorescencein situ hybridization, FISH)是 20 世纪 80 年代末发展起来的一种重要的原位杂交方法，以非放射性荧光标记取代放射性同位素标记，而形成的一种新的分子细胞遗传学技术。FISH技术作为非放射性检测体系，与放射性同位素标记的探针相比具有明显的优势:1.荧光试剂和探针较放射性同位素标记的探针更加经济安全；2.探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3.实验结果灵敏度高，特异性好，定位准确；4.多色FISH可通过在同一个核中显示不同的颜色，同时检测多种序列；FISH技术不但可以用于已知基因或序列的染色体定位，而且可以用于动物、植物、微生物克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究，此外，FISH技术在基因定性、定量、整合和表达方面的研究中具有优势。但是，目前广泛使用的经典荧光原位杂交方法中，关键的杂交步骤操作复杂，步骤繁琐，极大地降低了实验效率，为实验带来了极大的不确定性，此外，经典杂交步骤中需要使用具有毒性的变性试剂，威胁了实验操作人员的身体健康，也给环境造成了危害。
技术实现思路
本专利技术针对经典荧光原位杂交技术操作复杂，步骤繁琐，实验效率低，且需要使用有毒致畸试剂的缺点，提供了一种操作简便，步骤简单、实验效率高，且不使用有毒致畸试剂的共变性荧光原位杂交方法。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决:，包括如下步骤:步骤一制备玻片标本:样品经过EDTA-胰酶消化、低渗液处理、固定液固定处理后，滴片并烘烤，制得玻片标本；步骤二探针与染色体共变性和杂交:在玻片标本上，滴加探针溶液，加盖盖玻片后，封盖盖玻片与载玻片间的交界缝后，烘烤玻片标本，使探针与样品染色体共变性，共变性完成后，将玻片标本直于湿盒中鮮育；步骤三杂交后洗涤并染色:孵育完成后，取出玻片标本，移除封盖盖玻片与载玻片间交界缝的胶水，用SSC洗涤液洗涤玻片标本后，染色处理；步骤四信号检测:用荧光显微镜检测玻片标本。经过前处理后的样本经EDTA-胰酶处理，EDTA (乙二胺四乙酸)作为螯合剂，结合金属离子，消除重金属离子对酶的抑制作用，EDTA-胰酶消化细胞外的蛋白质。样品浸入低渗液中，低渗液渗透压低于细胞内的渗透压，水分迅速进入细胞，使细胞膨胀，染色体铺展，使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态，从而获得良好的染色体分裂相，有利于后续实验结果的观察，确保检测结果的准确性。固定液能迅速穿透细胞，将细胞固定并维持染色体结构的完整性，还能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。加入探针的玻片标本密封后，经过烘烤，高温使探针和待检测样品同时发生变性，染色体脱氧核糖核酸双螺旋结构解开，形成单链，变形完成后，温度降低，孵育探针和待检测样品，小分子探针与靶序列由于碱基互补配对结合，探针插入到待测样品中，指示靶序列的存在，指示染色体异常。杂交完成后，用SSC洗涤液洗涤玻片标本，洗去未结合的探针，避免未结合的探针显影，干扰检测结果。本专利技术的改良共变性荧光原位杂交中，探针与待检测样本的杂交过程不需经过乙醇的梯度脱水作用，免除了乙醇预冷冻等实验准备步骤，节约了大量试剂，降低了实验成本，此外，杂交过程不需要使用有毒的甲酰胺试剂，也免除了甲酰胺试剂的预热工作，有利于实验操作人员的身体健康，减少了环境污染，也极大地降低了实验操作复杂性，提高了实验效率，此外，简化实验步骤，也有利于提升检测结果的准确性。作为优选，步骤一中，低渗液为氯化钾和柠檬酸钠的混合水溶液，固定液为甲醇和乙酸的混合液。低渗液渗透压低于细胞内液，水分迅速进入细胞，使其膨胀，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态，获得分散良好的染色体分裂相。氯化钾 和柠檬酸钠的混合水溶液作为低渗液，具有使染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短的优点。固定液能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果，固定液为甲醇和乙酸混合配制成的固定液，可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失，实际使用中，可根据预实验的结果调整以适应于不同的待检样品。作为优选，步骤一中，烘烤温度为60-70°C摄氏度，烘烤时间10-20分钟。滴片并烘烤载玻片，保证细胞固着于载玻片。作为优选，步骤二中，盖玻片与载玻片间的交界缝采用环氧胶封盖。作为优选，步骤二中，玻片标本的共变性温度为73-75°C，共变性时间为40秒-2分钟。玻片标本置于73-75°C烘烤40秒-2分钟，高温使维持样品和探针双螺旋结构稳定的氢!键断裂，破坏喊基堆积力，待测样品和探针核酸闻级结构改变，染色体和探针的双螺旋高级结构解开，形成单链，为后续探针与样品中靶序列的结合做好准备。作为优选，步骤二中，孵育温度为36-38°C，孵育时间为8-16小时。共变性后的探针和待检测样品在36-38°C孵育8-16小时，保证探针和待检测样品中靶序列按照碱基互补配对原则结合，确保探针能准确定位于样品目标位点，指示样品中的目标序列。作为优选，步骤三中，SCC洗涤液为0.4 X SSC溶液和2 X SSC溶液，0.4 X SSC溶液中含有体积分数为0.3%的NP-40，2 X SSC溶液中含有体积分数为0.1%的NP-40。SSC洗涤液中的盐离子(Na+ )中和RNA/DNA主链上的负电荷，使其呈电中性,这样可以使探针和靶序列的结合更加容易进行。NP-40(乙基苯基聚乙二醇)是非离子去垢剂和表面活性剂，能提升SSC的洗涤效果。0.4X SSC洗涤液是低盐洗液，可以增加核酸链的严紧性，使得RNA/DNA之间的排斥力增加，2 X SSC洗涤液是高盐洗液，能洗去非特异性结合的探针，避免未与靶序列结合的探针释放荧光干扰检测结果。作为优选，步骤三中，0.4X SSC洗涤液预热温度为73-78°C。0.4X SSC洗涤液中含有NP-40，预热后可以更好地发挥NP-40的表面活性剂作用，提升清洗效果。作为优选，步骤三中，玻片标本染色采用DAPI染液。DAPI也称DAPIdihydrochloride,即 2-(4-Amidinophenyl)-6-1ndolecarbamidine dihydrochloride,分子式为C16H15N5.2HC1，分子量为350.25，CAS No:28718-90-3。DAPI是一种常用的多色核荧光染料，与A=T碱基对结合，其蓝色荧光颜色光鲜，显著区别于其他结构荧光探针所发出的绿、黄、红等荧光，方便区别待检测核酸与探针，实验结果明确，便于观察。本专利技术在现有技术的基础上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改良共变性荧光原位杂交方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一?制备玻片标本：样品经过EDTA?胰酶消化、低渗液处理、固定液固定处理后，滴片并烘烤，制得玻片标本；步骤二?探针与染色体共变性和杂交：在玻片标本上，滴加探针，加盖盖玻片后，封盖盖玻片与载玻片间的交界缝，烘烤玻片标本，使探针与样品染色体共变性，共变性完成后，将玻片标本置于湿盒中孵育；步骤三?杂交后洗涤并染色：孵育完成后，取出玻片标本，移除封盖盖玻片与载玻片间交界缝的胶水，用SSC洗涤液洗涤玻片标本后，染色处理；步骤四?信号检测：用荧光显微镜检测玻片标本。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曾艳，
申请(专利权)人：曾艳，
类型：发明
国别省市：