本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体地，公开了一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物及检测试剂盒。所述引物是根据柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫7种艾美耳球虫的IGS和ITS特异序列设计得到。将这7对引物用于制备得到的荧光定量PCR试剂盒可以准确、客观并定量检测出以上7种鸡艾美耳球虫，而且，检测试剂盒的特异性和灵敏性非常高。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于生物检测
，具体地，公开了一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物及检测试剂盒。所述引物是根据柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫7种艾美耳球虫的IGS和ITS特异序列设计得到。将这7对引物用于制备得到的荧光定量PCR试剂盒可以准确、客观并定量检测出以上7种鸡艾美耳球虫，而且，检测试剂盒的特异性和灵敏性非常高。【专利说明】一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物及检测试剂盒
本专利技术涉及生物检测技 术领域，具体地，涉及一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物及检测试剂盒。
技术介绍
鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种常见的寄生虫病。该病危害极为严重，每年全球因球虫病的感染造成大约30亿美元的损失，是鸡病中引起经济损失最为严重的疾病之一。现已发现并公认的鸡艾美耳球虫有7种，即柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫，所有的球虫均有一定的致病性。该病分布很广，感染时常表现两种或两种以上的混合感染，发病率高达50%-70%，死亡率为20%-30%，严重者高达80%。病愈的鸡生长发育受阻，增重缓慢，成年鸡多为带虫者，对养鸡业危害极大，据统计每年给中国养鸡业造成数十亿元损失。其中，致病力最强的是柔嫩艾美耳球虫，分布也最为广泛，其主要寄生于盲肠。其次是毒害艾美耳球虫，主要寄生于小肠。在集约化鸡场中，鸡大多情况下混合感染多种球虫，因此球虫种类的诊断鉴别更为复杂和困难。长期以来，球虫的分类和鉴定主要依赖于卵囊和孢子囊的形态特征(即形状和大小)、肠道中寄生部位、最短潜在期、最短孢子化时间、肠道病变、致病性和免疫原性等生物学特征。然而各个虫种之间的特征性指标不是十分明显，而且球虫又多是混合感染，有些鉴定指标还依赖于实验操作人员的主观判断，不同的操作人员很有可能得出不一样的结论。因此尽管这些鉴定指标迄今仍然用于鸡球虫的流行病学研究中，但临床上急需更为准确和操作方便的鉴定方法。自1985年Mullis等创立聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术以来，它已成为分子生物学领域最为常见的方法之一。并且以PCR技术为基础，经过不断的探索和完善，研究者们已发展出多种相关技术应用于寄生虫遗传变异和种类鉴定的分子生物学方法研究，包括特异PCR、DNA序列分析、多重PCR、扩增片段长度多态性(AFLP)、聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性(PCR-RFLP )、随机扩增多态性DNA (RAPD )、单链构象多态性(SSCR)以及荧光定量PCR等，为分子寄生虫学和分子遗传学的发展提供了有利的工具。荧光定量PCR原理是以荧光共振能量转移为基础，在反应体系中加入荧光探针或荧光染料，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR的反应过程。荧光染料可以结合在DNA双链的小沟中，当DNA扩增时，荧光染料可以与dsDNA结合，发出荧光信号，并且随着dsDNA的逐渐增多，荧光信号逐渐增强，当信号达到阈值时，荧光信号即可被荧光定量PCR仪器检测到。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。通过对不同稀释倍数的标准样品做荧光定量PCR，即可做出标准曲线。利用标准曲线可以对未知样品进行定性和定量检测。常用的荧光染料有Pico Green和SYBR Green，荧光染料法相对于荧光探针优势在于检测方法简单，检测成本低。实时荧光定量PCR技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有灵敏度高，特异性强，自动化程度高等优点，并且能有效解决PCR污染问题。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术球虫种类的诊断鉴别技术不准确和复杂的缺陷，提供一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物。本专利技术的另一个目的是提供一种定量检测七种鸡艾美耳球虫的荧光定量PCR试剂盒。本专利技术通过以下技术方案予以实现上述目的: 一种检测七种鸡艾美耳球虫的引物,核苷酸序列如下: Tn引物对序列如SEQ ID NO:1-2所示； Ne引物对序列如SEQ ID NO:3-4所示； Mx引物对序列如SEQ ID NO:5-6所示； Ac引物对序列如SEQ ID NO:7-8所示； Mt引物对序列如SEQ ID NO:9-10所示； Pr引物对序列如SEQ ID NO: 11-12所示； Br引物对序列如SEQ ID NO: 13-14所示； 其中，Tn引物对用于检测柔嫩艾美耳球虫；Ne引物对用于检测毒害艾美耳球虫；Mx引物对用于检测巨型艾美耳球虫.Μ引物对用于检测堆型艾美耳球虫；Mt引物对用于检测和缓艾美耳球虫；Pr引物对用于检测早熟艾美耳球虫；Br引物对用于检测布氏艾美耳球虫。以上引物对是专利技术人通过对来自于不同流行区的鸡艾美耳球虫分离株的核糖体DNA进行遗传变异分析，发现核糖体IGS序列和ITS序列在同种不同株艾美耳球虫间差异很小，而在不同种间的差异非常大。因此本 申请人:根据7种艾美耳球虫的IGS和ITS特异序列设计了上述引物对。一种定量检测七种鸡艾美耳球虫的荧光定量PCR反应体系，如上所述7对引物各自配制一个反应体系，共配制7个反应体系；每个反应体系为SYBR GREEN I反应混合液8μl，引物各1μl，双蒸水10μl，待检测样品DNA模板5μl。 所述每个反应体系的荧光定量PCR扩增条件为95°C预变性30s ;95°C变性5 s,60°C退火1min,80°C延伸I min,在此处采集突光,共40个循环。一种定量检测七种鸡艾美耳球虫的荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒含有如下成分:待检测粪便样品DNA提取液，SYBR GREEN I反应混合液；终浓度为50 ρπιο?/μ?的如上所述的各引物对。所述试剂盒还含有I mm的玻璃珠和Inhibit Ex Tablet。所述待检测粪便样品DNA提取液含有ASL Buffer、proteinase K、Buffer AL、Buffer AffUBuffer Aff2,Buffer AE、96%-100%酒精、10%次氯酸钠；以上每种溶剂单独存放于一溶剂瓶中。其中，ASL Buffer、proteinase K、Buffer AL、Buffer AWl、Buffer Aff2和Buffer AE来源于天根的DNA提取试剂盒，当然，本专利技术所述待检测粪便样品DNA的提取也可以采用本领域其它常规的粪便DNA的提取方法。所述SYBR GREEN I反应混合液是从TaKaRa公司购买的试剂，其组成为:TaKaRaEx Taq HS、dNTP Mixture、Mg2+和 SYBR?Green I。优选地，所述试剂盒的容量规格一般为50个反应的量，因此，所述试剂盒含有的待检测粪便样品DNA提取液组分为:50个反应的140 mL的ASL BufferU.4 mL的proteinase K、33 mL 的 Buffer AL、19 mL 的 Buffer Affl>13 mL 的 Buffer AW2>12 mL 的Buffer AEUO mL的96%-100%酒精和100 mL的10%次氯酸钠； 荧光定量P本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测七种鸡艾美耳球虫的引物，其特征在于，核苷酸序列如下：Tn引物对序列如SEQ?ID?NO:1~2所示；Ne引物对序列如SEQ?ID?NO:3~4所示；Mx引物对序列如SEQ?ID?NO:5~6所示；Ac引物对序列如SEQ?ID?NO:7~8所示；Mt引物对序列如SEQ?ID?NO:9~10所示；Pr引物对序列如SEQ?ID?NO:11~12所示；Br引物对序列如SEQ?ID?NO:13~14所示；其中，Tn引物对用于检测柔嫩艾美耳球虫；Ne引物对用于检测毒害艾美耳球虫；Mx引物对用于检测巨型艾美耳球虫；Ac引物对用于检测堆型艾美耳球虫；Mt引物对用于检测和缓艾美耳球虫；Pr引物对用于检测早熟艾美耳球虫；Br引物对用于检测布氏艾美耳球虫。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：翁亚彪，刘国昌，林瑞庆，袁子国，吴林林，王新秋，段雯方，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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