体外确定个体患结直肠癌概率的方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及在外周血样品中体外确定个体患结直肠癌概率的方法，使用待测个体基因的核酸表达产物的量与得自组成阳性对照的CRC患者组的相同基因的核酸表达产物的量及与得自组成阴性对照的CNC个体组的相同基因的核酸表达产物的量的比较；还涉及包含所述表达产物的特异性结合配偶体的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及在外周血样品中体外确定个体患结直肠癌概率的方法，使用待测个体基因的核酸表达产物的量与得自组成阳性对照的CRC患者组的相同基因的核酸表达产物的量及与得自组成阴性对照的CNC个体组的相同基因的核酸表达产物的量的比较；还涉及包含所述表达产物的特异性结合配偶体的试剂盒。【专利说明】体外确定个体患结直肠癌概率的方法及试剂盒专利
本专利技术涉及检测结直肠癌，特别涉及用于确定患这种癌症的概率的方法及试剂盒。背景结直肠癌(CRC)也称为结肠癌或大肠癌，是美国第五最常见癌症形式，中国第四位常见癌症及欧洲癌症相关死亡的第三位因素。CRC早期检测是成功治疗及患者存活的关键，代表主要公共健康挑战。事实上，CRC经常是可治愈的，特别是当在早期诊断时。在各个国家已有一些筛查策略。传统CRC筛查测试包括大便潜血试验(F0BT)、乙状结肠镜检测结肠镜检查、双重对比钡剂灌肠、或者直肠指检。所有这些均具有优点和限制，但是依从性仍低于预期，主要由于患者的不便或者不适。寻找目的在于CRC早期检测的外周血生物学标记物几年来成为焦点，特别是因为其方便性。同时，只有极少研究支持基于血液的测试的可行性，这些研究发现血液中的基因生物学标记物可以区分CRC患者和对照。这些研究基于流式细胞术，其是计数和检查显微颗粒如细胞的技术，所述技术通过将它们悬浮在液流中并用电子检测装置分析它们。本专利技术人发现，在外周血样品中，差异表达的基因代表重要的生物学标记物。它们不使用经典流式细胞术技术，而是确定来自全血的基因的差异表达。通过分析全血中的转录物来确定基因表达水平是不寻常的，因为本领域技术人员普遍承认，当无特异性纯化步骤时，非常难以获取稀释于RNA复杂混合物(总RNA)中的特异信息。本专利技术方法的优势还包括避免RNA纯化步骤。因此，本专利技术涉 及在外周血样品中体外确定个体患结直肠癌概率的方法，所述方法包括步骤:a)在外周血样品中确定来自至少一种核酸序列且不超过7种核酸序列的至少一种表达产物的量，所述核酸序列选自SEQ ID NO: 1-11的序列，b)将步骤a)中确定的所述表达产物的量与一组先前诊断为结直肠癌患者的个体的表达产物的参考量以及与一组先前确认为非结直肠癌个体的个体的表达产物的参考量进行比较，c)进行步骤b)结果的分析，其中:-如果测试个体的结果接近或等于得自先前诊断为结直肠癌患者的个体组的结果，则该测试个体被分类为结直肠癌患者，而-如果测试个体的结果接近或等于得自先前确认为非结直肠癌个体的个体组的结果，则该测试个体被分类为非结直肠癌个体。表达产物的量直接与由其核酸序列限定的基因的表达水平相关。至少一种上述核酸的表达水平是确定个体是否是CRC的足够信息。但是，在本专利技术优选实施方案中，在步骤a)中，来自选自下组的核酸序列的表达产物的量被确定:SEQ IDN0:USEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 或 SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ ID NO:6, SEQ IDN0:7 或 SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 和 SEQ ID NO:11。来自核酸的表达产物的量通过将所述表达产物与特异于每种表达产物的至少一种结合配偶体接触而确定。表达产物是指RNA转录物或多肽。因此，在本专利技术方法中，至少一种RNA转录物或至少一种多肽的量被确定。术语RNA转录物是指总RNA，即直接得自外周血样品或细胞裂解后间接得自血液样品的编码或非编码RNA。特别地，总RNA包含转移RNA (tRNA)，信使RNA (mRNA)，如从靶基因转录也从其他基因转录的mRNA，以及核糖体RNA。具体说明，当RNA是胞内RNA时，其可以通过裂解步骤从血液样品中存在的细胞提取，以释放待测个体细胞中含有的核酸。例如，可以使用如下专利申请中描述的裂解方法:W000/05338，涉及混合磁性及机械裂解，W099/53304,涉及电裂解，W099/15321，涉及机械裂解。本领域技术人员可以使用其它熟知裂解方法，例如热休克或渗透压休克，或者使用离液剂如胍盐的化学裂解(美国专利号5，234，809)。还可以提供额外步骤以从裂解步骤释放的其它细胞组分分离核酸。这通常能够浓缩核酸。在本专利技术方法中，RNA转录物可以通过杂交、扩增或测序检测及量化。特别地，为检测及量化，RNA转录物与至少一种探针或至少一种引物在预定条件下接触，所述预定条件使得所述探针和/或所述引物与所述RNA转录物杂交。但是在本专利技术另一个实施方案中，制备RNA转录物的DNA拷贝，通过与至少一种探针或至少一种引物在预定条件下接触，所述预定条件使得所述探针和/或所述引物与所述DNA拷贝杂交而确定所述DNA拷贝。更精确地，在上述方法中，RNA转录物或DNA拷贝与至少一种杂交探针和至少一种引物接触，更特别与至少一种杂交探 针和两种引物接触。术语“杂交”是指这样的过程，其中在合适条件下，两个核苷酸片段以稳定和特异性氢键结合以形成双链复合物。这些氢键在互补腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))碱基之间形成(称为A-T键)或者在互补的鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)碱基之间形成(称为G-C键)。两个核苷酸片段的杂交可以是完全的(称为互补核苷酸片段或序列)，即在这个杂交过程中获得的双链复合物仅包含A-T键及C-G键。这个杂交可以是部分的(称为足够互补的核苷酸片段或序列)，即获得的双链复合物包含使得能形成双链复合物的A-T键和C-G键，也包含不结合互补碱基的碱基。两个核苷酸片段之间的杂交取决于使用的工作条件，特别取决于严格性。严格性特别定义为两个核苷酸片段的碱基组成的函数，也通过两个核苷酸片段之间的错配程度限定。严格性也可以取决于反应参数，例如杂交溶液中存在的离子种类的浓度及类型，变性剂的性质及浓度，和/或杂交温度。所有这些数据均是熟知的并且本领域技术人员可以确定合适的条件。通常，根据要杂交核苷酸片段的长度，杂交温度在大约20和70°C之间，特别是在35和65°C之间，在浓度大约0.5-1M的盐水溶液中。序列或核苷酸片段或寡核苷酸或多核苷酸是通过磷酸酯键组装在一起的一系列核苷酸基序，特征在于天然核酸的信息序列，能够与核苷酸片段杂交，该系列可以含有不同结构的单体，可以得自天然核酸分子和/或通过遗传重组和/或通过化学合成获得。基序是单体衍生物，其可以是核酸的天然核苷酸，其组成元件是糖、磷酸基团和含氮碱基；在0嫩中，糖是脱氧-2-核糖，在RNA中，糖是核糖；根据涉及DNA或RNA，含氮碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；或者单体是在三种组成元件中的至少一种中被修饰的核苷酸；例如，修饰可以发生在碱基水平，修饰的碱基例如肌苷、甲基-5-脱氧胞苷、脱氧尿苷、二甲基氨基-5-脱氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脱氧尿苷或者任何其它能杂交的修饰碱基，或者修饰可以发生在糖水平，例如用聚酰胺置换至少一个脱氧核糖(P.E.Nielsen et al, Science, 254,1497-1500(1991))，或者修饰可以发生在磷酸基团水平，例如其用酯特别选自二磷酸酯、烷基膦酸酯和芳基膦酸酯及硫代磷酸酯置换。为本专利技术目的，术语“扩增引物”是指包含5-100本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶迅，吴非，徐清华，刘芳，孟夏，B·穆然，
申请(专利权)人：生物梅里埃公司，
类型：
国别省市：