本发明专利技术提供了一种用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法检测乙肝表面抗原（HBsAg）的方法，其通过将带有活化羧基的金属胶体颗粒共价连接乙肝病毒表面抗体（HBsAb），血清中的HBsAg与胶体颗粒标记的HBsAb通过特异性反应结合生成免疫复合物；在酸性条件下将胶体颗粒从免疫复合物中解离，再通过ICP-MS检测金属离子信号，从而间接检测HBsAg。由于每个胶体颗粒可连接一个或多个抗体分子，从而使得检测的灵敏度得到较大的提高；该方法克服了传统的胶体金免疫层析法、酶联免疫分析法等准确度低的弊端，具有优良的准确性和高灵敏度，且免疫分析检测方便、迅速，拓宽了ICP-MS在免疫分析上的应用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供了一种用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法检测乙肝表面抗原（HBsAg）的方法，其通过将带有活化羧基的金属胶体颗粒共价连接乙肝病毒表面抗体（HBsAb），血清中的HBsAg与胶体颗粒标记的HBsAb通过特异性反应结合生成免疫复合物；在酸性条件下将胶体颗粒从免疫复合物中解离，再通过ICP-MS检测金属离子信号，从而间接检测HBsAg。由于每个胶体颗粒可连接一个或多个抗体分子，从而使得检测的灵敏度得到较大的提高；该方法克服了传统的胶体金免疫层析法、酶联免疫分析法等准确度低的弊端，具有优良的准确性和高灵敏度，且免疫分析检测方便、迅速，拓宽了ICP-MS在免疫分析上的应用。【专利说明】
本专利技术属于质谱分析领域，具体涉及。
技术介绍
中国是乙型病毒肝炎的高发国家。根据流行病学调查，人群发生率较高，表面抗原携带率约为15%。乙肝病毒的实验诊断对于其治疗及预防有重要的参考意义。乙肝表面抗原(HBsAg)是HBV感染后第一个出现的血清学标志物，也是诊断的重要指标之一。出于检测成本等原因，国内大多数临床实验室都采用酶联免疫吸附法(ELISA)来检测HBsAg。但对于HBsAg浓度较低的标本，检测时常因方法学的原因造成灵敏度较低，检测范围窄，导致临床出现漏检，给病人带来损失，尤其是需要临床输血的病人。而其它如放射免疫法、化学发光免疫法以及荧光免疫法等方法虽然具有灵敏度高、线性范围宽等特点，但因其具有辐射危害、对标记物的选择有限等而限制了其更广泛的应用。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)是20世纪80年代发展起来的多元素分析手段，具有灵敏度高、检出限低、选择性好、线性动态范围宽、能够进行多元素同时测定和同位素比测定等优点；将其与多种分离技术及进样方法相结合，可以用于复杂体系的痕量或超痕量元素分析。随着ICP-MS技术的日趋成熟，应用领域也在不断拓宽。而纳米粒子的生物标记研究为ICP-MS在免疫分析上的应用带来了一次革命性的发展。由于纳米生物探针中的各种无机金属纳米离子均可以通过ICP-MS测定，因此，ICP-MS有可能成为一种简单、高灵敏度、成本低廉的纳米离子生物探针的新检测方法。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供，该方法具有较高的准确性和灵敏度，免疫分析检测方便、迅速，可用于临床分析。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案: ，其包括下述步骤: 1)制备带有活化羧基官能团的金属胶体溶液:用浓度为0.01 11101/1、?!1值为7.2—7.6的磷酸盐缓冲液(PBS)分别溶解1-乙基-3-(3- 二甲氨丙基)碳二亚(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，配制成浓度均为20 mg/mL的溶液，然后将其与金属胶体溶液按摩尔比nEDC:nNIB:nMJK#= 5:7.5:1混和，于4°C振荡30 min使羧基活化形成活泼酯,再经高速离心分离使金属纳米颗粒沉降，弃去上清液，得到活化后的金属胶体溶液； 2)纳米胶体溶液标记乙肝表面抗体(HBsAb)b:将步骤I)所得活化后的金属胶体溶液的pH调至6.2 (可选用0.lmol/L K2CO3或0.lmol/L HCl调节pH)，加入HBsAb于4°C恒温震荡Ih (使抗体与羧基活化的胶体溶液充分接触，发生共价偶联反应)，再逐滴加入牛血清蛋白(BSA)使其终浓度为I % (质量百分比)；然后于4°C、2000转/分离心30min (用以弃去大粒子沉淀)，取上清夜50000转/分4°C离心60 min,弃去上清夜中未结合的蛋白质,取沉淀用含1% BSA的磷酸盐缓冲液(PBS，0.0lmol/L.pH = 7.4，由磷酸氢二钾、磷酸二氢钾配置而成)溶解，重复离心2次，将沉淀悬浮于PBS中(0.0lmol/L, pH = 7.4)，再加入叠氮化钠(NaN3) ,BSA使其终浓度分别为0.04%和I % (质量百分比)，所得溶液即为纳米金属颗粒标记的抗体溶液，于4°C放置备用； 3)构建免疫过程:将含不同浓度HBsAg的碳酸盐缓冲溶液(缓冲液浓度0.01 mol/L、pH9.6，由碳酸钠和碳酸氢钠配制而成)加入到各聚乙烯板的孔中，4°C放置过夜(12h);用洗涤缓冲液洗涤聚乙烯板的各孔；每孔加入含1% BSA的PBS (0.01 mol/L, pH = 7.4)，37°C温育反应I h (用以封闭活性位点)；然后加入步骤2)所得纳米金属颗粒标记的抗体溶液于37°C反应2 h (用以通过免疫反应生成免疫复合物)；最后用洗涤缓冲液充分洗涤聚乙烯板的各孔； 4)金属离子信号检测:在聚乙烯板的各孔中加入2%(体积百分比)的硝酸溶液，超声15min (用以使纳米金属颗粒从免疫复合物中解离下来)，然后用蠕动泵将样品带入ICP-MS，测定金属离子信号； 5)根据金属离子在ICP-MS中的强度与HBsAg的浓度呈线性关系，绘制工作曲线。步骤I)中所述金属胶体溶液中的胶体颗粒为CdSe、ZnSe, CdS、CdTe或金胶颗粒中的任意一种；且优选为水相中直接制备的、用巯基丙酸(MPA)或其它含羧基化合物修饰的胶体溶液。步骤3)中所用洗涤缓冲液是由浓度0.01mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液、质量浓度0.1%的BSA和质量浓度0.05%的Tween-20组成的混合溶液。和现有技术相比，本专利技术的优点: 本专利技术方法用带有活化羧基的金属胶体颗粒标记HBsAb，且很好地保持其生物活性；然后通过特异性的免疫反应，将一定浓度的HBsAg与HBsAb结合；利用ICP-MS检测标记抗体的金属离子信号，从而实现间接检测HBsAg的目的。该方法克服了传统的胶体金免疫层析法、酶联免疫分析法等准确度低的弊端，拓展了 ICP-MS技术在生物医学领域的应用。由于金属胶体颗粒粒径小，可以同时标记一个或多个抗体分子，从而显著提高了检测的灵敏度。此外，结合ICP-MS技术线性范围宽、灵敏度高、检测迅速等优点，则使得本专利技术的HBsAg检测方法表现出了高灵敏度以及优良的准确性，且免疫分析检测方便、迅速，相对于传统的酶联免疫分析方法有了进一步的提高，可用于临床分析。【专利附图】【附图说明】图1是本专利技术方法中的构建免疫过程示意图； 图2中，a为实施例1制备的ZnSe胶体溶液的电镜图片，b为实施例2制备的纳米金胶体溶液的电镜图片； 图3中的a、b分别为实施例1和实施例2中HBsAg浓度与标记金属离子信号的线性关系O【具体实施方式】以下通过具体实施例来说明本专利技术的技术方案，但本专利技术的保护范围并不局限于此。实施例1 一种基于ZnSe胶体溶液标记抗体的HBsAg的ICP-MS检测方法，其包括下述步骤: I)制备ZnSe胶体溶液: 制备:参照文献进行，具体为:量取125mL的二次蒸馏水充氮除氧I h，然后在搅拌条件下向水中加入 0.875g (2.35 mmol)ZnC104.6Η20 与 5.7 mmol 的 MPA (用作稳定剂)，用 I mol/L 的NaOH溶液将反应溶液的pH值调节为6.5，继续向溶液中通氮气除氧。搅拌下，加入0.134g(0.46 mmol Ml2Se3及过量硫酸进行反应(用以产生新鲜的H2Se3),在此状态下，产生了 ZnSe的前驱体。然后加热回流2 h本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用电感耦合等离子体质谱法检测乙肝表面抗原的方法，其特征在于，包括下述步骤：1）制备带有活化羧基官能团的金属胶体溶液：用浓度为0.01?mol/L、pH?值为7.2―7.6的磷酸盐缓冲液分别溶解1?乙基?3?(3?二甲氨丙基)碳二亚胺和N?羟基琥珀酰亚胺，配制成浓度均为20?mg/mL的溶液，然后将其与金属胶体溶液按摩尔比nEDC：n?NHS：n金属胶体＝5：7.5：1混和，于4℃振荡后离心分离，弃去上清液，得到活化后的金属胶体溶液；2）胶体溶液标记HBsAb：将步骤1）所得活化后的金属胶体溶液的pH调至6.2，加入HBsAb于4℃恒温震荡1h，再加入牛血清蛋白使其终浓度为1％；然后于4℃、2000转/分离心30min，取上清夜50000转/分4℃离心60?min，取沉淀用含1％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液溶解，重复离心2次，将沉淀悬浮于磷酸盐缓冲液中，再加入叠氮化钠、牛血清蛋白使其终浓度分别为0.04％和1％，所得溶液即为纳米金属颗粒标记的抗体溶液，于4℃放置备用；3）构建免疫过程：将含不同浓度HBsAg的碳酸盐缓冲溶液加入到各聚乙烯板的孔中，4℃放置12h；用洗涤缓冲液洗涤聚乙烯板的各孔；然后每孔加入含1％牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液，37℃温育反应1?h；再加入步骤2）所得纳米金属颗粒标记的抗体溶液于37℃反应2?h；最后用洗涤缓冲液洗涤聚乙烯板的各孔；4）金属离子信号检测：在聚乙烯板的各孔中加入2％的硝酸溶液，超声15?min，然后用蠕动泵将样品带入ICP?MS，测定金属离子信号；5）根据金属离子在ICP?MS中的强度与HBsAg的浓度呈线性关系，绘制工作曲线。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘珂珂，刘冲，庞海岩，刘清，黄海平，段显英，褚艳红，
申请(专利权)人：河南省科学院高新技术研究中心，
类型：发明
国别省市：
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