大麦原生质体制备及PEG介导转化方法技术

本发明专利技术涉及原生质体的培养技术，旨在提供一种大麦原生质体制备及PEG介导转化方法。该方法包括：大麦幼苗的培养、原生质体的制备，以及大麦原生质体的PEG介导转化过程，涉及酶液、W5试剂、PEG–Ca2+试剂、WI试剂的使用。与悬浮细胞体系相比，本发明专利技术以大麦幼苗为材料更加省时，省力。通过选取大麦幼苗的茎及叶片为材料，进行原生质体的的提取与转化，均能得到理想的转化效率，转化效率为70%-80?%。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
用于PEG介导转化的大麦原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）大麦幼苗的培养大麦种子经自来水中浸泡2?h后，用10％次氯酸钠表面消毒30?min，再用ddH2O清洗8次；消毒后的种子平铺在湿滤纸上，25℃下萌发；36?h后，种子露白，选取长势良好的种子进行水培法培养：在pH?5.8的0.1mmol·L?1?CaCl2培养液中，以8小时光照/16小时黑暗的条件于25℃培养5天后，得到用于原生质体提取试验的大麦幼苗；（二）原生质体的制备（1）首先配制酶液10ml和0.3M甘露醇10?ml；所述酶液的组份为：0.3?M的甘露醇、10?mM的MES、1.5%（wt/vol）的纤维素酶R10、0.75%（wt/vol）的离析酶R10、1mM的CaCl2、0.1%（wt/vol）的BSA、1?mM的β?巯基乙醇，余量为ddH2O；（2）取50棵幼苗的茎段或5?7片叶子于灭菌的滤纸上，用新的刀片将其切成0.5?1?mm的薄片，切好后迅速加到有10?ml??0.3?M甘露醇的100?ml三角瓶中，以锡箔纸包好三角瓶，黑暗中放置10?min；（3）用移液器弃甘露醇，尽量吸净；加入10?ml酶液，锡箔纸包好三角瓶，放入真空罐中，抽真空条件200?psi以下，平板摇床上30转/分钟培养30?min；从真空罐中取出三角瓶，空气中平板摇床上30转/分钟，培养3.5?h；（4）加入等体积的W5试剂，平板摇床上40转/分钟，培养10?min；所述W5试剂的组份为：154?mM?的NaCl、125?mM?的CaCl2、5?mM?的KCl?、2?mM?的MES?，余量为ddH2O?；（5）用W5试剂润湿100目的细胞筛，过滤步骤（4）中的培养产物，滤液用50?ml圆底离心管收集，再用20ml?W5试剂冲洗；（6）500?rcf常温离心3?min后，吸去上清；试管底部为绿色的一层原生质体；（7）加入2?ml?W5试剂，轻柔摇晃离心管，使细胞悬浮；吸取细胞悬浮液至10ml圆底离心管中，锡箔纸包好使离心管避光，原生质体自然沉降30?min后，500?rcf离心3?min；移液器小心移去上清；留在圆底离心管底部的即为大麦原生质体。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：边红武，韩凝，朱睦元，白玉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：