本发明专利技术提供的大黄酸高产菌株腐皮镰刀菌R13(FusariumsolaniR13)，其保藏号是CCTCC?NO:M?2013009，保藏单位是中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期是2011年1月9日。该菌株是从蓼科大黄属掌叶大黄活体中分离筛选得到的内生真菌，该菌株经液体发酵后能产生与其宿主掌叶大黄相同或相似的物质：大黄酸和大黄素，该类大黄酸、大黄素以游离态存在发酵上清液中。本发明专利技术还提供了发酵生产大黄酸的方法，通过液态发酵在25-28℃代谢产生大黄酸产率可达到5mg/L以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药用微生物
，具体涉及到从药用植物掌叶大黄中分离出的一株内生真菌腐皮镰刀菌R13 (Fusarium solani R13),该菌株通过液体发酵能产生大黄酸和大黄素，可用于大量生产大黄酸或其类似物。
技术介绍
大黄是寥科大黄属植物掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheumtanguticum Maxim, ex Balf.)或药用大黄(Rheum officinale Bai 11)的干燥根及根莖，又名将军，具泻热通便、凉血解毒、逐瘀通经的功效，是临床最常用的药物之一。它的活性成分大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等具有具抗菌、抗肿瘤、抗病毒、保肝、强心、延缓衰老、调节免疫功能等作用。随着大黄中有效成分的分离纯化以及色谱技术的广泛应用，从上世纪80年代开始大黄中单体的研究。例如大黄酸(Rhein, 4，5-dihydroxyanthraquinone)属单蒽核类1，8-二羟基蒽醌衍生物，是掌叶大黄、虎仗等多种传统中药的主要有效成分之一。近年来发现大黄酸具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、保肝抗纤维化、抗突变、抗多药耐药和联合用药、改变肾脏基因表达谱、改善细胞代谢、调脂作用等药理学作用。大黄素具有诸多抗炎、抗病毒、抑菌、免疫调节、保护肝肾、促进胃肠蠕动、抗氧化、清除自由基、改善微循环等药理学作用。大黄已广泛应用于临床，如用于黄疸、急性胰腺炎等的治疗，大黄酸的1,8-二乙酰化物(Diacerein)已用于治疗骨关节炎，其有效物质形式应为大黄酸。大黄酸已经从传统的泻药成分转变成为一种具有广泛生理作用的新型药物单体。经过结构修饰制备大黄酸偶联物以及衍生物，可改善大黄酸溶解性。利用大黄酸的骨趋向性作为药物骨靶向制剂载体，研制高 效低毒的新型抗肿瘤药也日益成为关注的重点。随着大黄酸药物单体需求研究，单体大黄酸生产愈发重要。内生真菌(Endophytic fungus)是指生活在健康植物组织内部,但不引起植物病害的真菌，在植物组织中普遍存在。内生真菌与宿主在长期的生态系统演化中形成了互惠共生关系，可产生与宿主相同或不同的具有生物活性的次生代谢产物。1993年，Strobel从短叶红豆杉中分离到一株能够产生紫杉醇的内生真菌(Taxomyces andreanae),这为抗肿瘤药物的研究增添了新的途径。一系列的科学研究表明，植物内生真菌既能够产生与宿主植物相同或相似的有效活性物质，也能够产生其他有活性的天然产物。内生真菌的天然产物种类十分丰富，几乎涵盖了所有的天然产物的类型，因此内生真菌为天然产物的发现提供了广泛的资源。
技术实现思路
本专利技术涉及一种从掌叶大黄(Rheum Palmatum L.)中分离出的一株产大黄酸的内生真菌。该内生真菌经形态学和rDNA ITS序列分析鉴定是腐皮镰刀菌属(Fusariumsolani)，是一种丝状真菌。可用于大量生产大黄酸或其类似物。本专利技术的技术方案。本专利技术采用严格的表面灭菌方法，从植物掌叶大黄活体植物中分离得到植物内生真菌R13,经rDNA ITS序列分析，即核糖rDNA内部转录间隔区(Ribosomal DNA InternalTranscribed Spacer)序列分析技术,结合微生物学形态学鉴定证明该菌株属于腐皮镰刀菌属(Fusarium solani)。该菌株已于2013年I月9日送交保藏湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC N0:M2013009o本专利技术所述的腐皮镰刀菌R13菌株的分离及筛选流程。首先，从中国四川省若尔盖草原采集掌叶大黄活体植株，选择健康完好的植物进行表面清洗和消毒，在无菌的环境下，对根、茎、叶和花进行切段，接着放入马铃薯葡萄糖培养基(PDA)培养皿中，于培养箱中培养，观察菌落生长情况，一般5-10天可看到切段周围有丝状真菌长出；对长出的真菌进行分离纯化后保种并进行液体发酵培养，提取菌丝体中的蒽醌，以标准品大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素对照，进行高效液相色谱(HPLC)检测，根据色谱图筛选产大黄酸的菌株；对初筛菌株进行高效液相色谱质谱连用(LC-MS)分析，进一步的确定产大黄酸的能力，对分析后确定产大黄酸的菌株进行系统分类学研究，包括形态学和分子生物学水平鉴定。菌株分类学地位的鉴定。1.固体培养特征。采用PDA培养基(土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加水定容1L，PH自然)培养腐皮镰刀菌Rl3菌株。菌落形态:28°C培养3 4天，菌落直径达30mm，7天时基本长满培养皿，菌落为圆形，前期为白色，后期为紫红色；菌落中间紫红色 ，绒毛状，菌落边缘相对整齐，白色，中间颜色较深，边缘较浅，随着培养时间的增长，整个平板培养基都呈红色。菌丝形态:菌丝分枝，有隔，菌丝宽度2-3 μ m。产孢特征:小型分生孢子多为单细胞，少数为1-2个分隔，有卵形、肾形等。大型分生孢子散生于菌丝上，大多数有3个分隔且分隔明显，形状为镰刀形，顶端形状渐尖。2.rDNA ITS 序列分析。2.1提取菌丝体总DNA。2.2 以 ITSl(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATAGC-3’ )为引物，扩增出rDNA ITS序列，经过测序，得到核苷酸序列SQE ID NOl0该序列包含了其两端的18S rDNA、28S rDNA的部分序列和中间ITSl区、5.8S r DNA、ITS2区的完整序列。2.3 将测序结果递交 http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast 进行序列比对，最后根据BLAST结果和形态学特征得出该分离的内生真菌属于腐皮镰刀菌属(Fusariumsolani)。2.4腐皮镰刀菌R13中大黄酸产量确定。2.4.1腐皮镰刀菌R13接种至改良的察氏培养基中，液体发酵培养10d，每天收集发酵液并提取发酵液，采用高效液相(HPLC)定量分析提取液，结果表明，液体发酵72小时后开始产大黄酸，经过192小时发酵后,发酵液中大黄酸产量达到最大值5.672mg/L0本专利技术效果。1.本专利技术为大黄酸和大黄素的开发提供了一株新的微生物菌株。2.本专利技术所述对象属于微生物，可以通过发酵的方式获得化合物，微生物生长繁殖迅速，不受气候与地域的限制，产量提升空间较大。3.本专利技术能够避免对植物掌叶大黄野生植物的过度开发，达到环境和生态的保护。附图说明序列表1:本专利技术分离得到的腐皮镰刀菌R13的rDNA ITS基因序列。图1:分离得到的掌叶大黄内生真菌腐皮镰刀菌R13菌落形态图。图2:腐皮镰刀菌R13发酵提取液和大黄酸标准品HPLC图谱。图3:大黄素标品和大黄酸标品的HPLC-MS质谱图。图4:腐皮镰刀菌R13代谢物的HPLC-MS质谱图。图5:腐皮镰刀菌R13聚类分析图。图6:腐皮镰刀菌R13菌丝细胞、镰刀孢子显微照片。图7:腐皮镰刀菌R13中大黄酸产量图。 生物材料样品保藏信息。保藏日期:2013年I月9日。保藏编号:CCTCCN0:M2013009o分类命名:腐皮镰刀菌R13 (Fusarium solani R13)。保减单位名称:中国典型培养物保减中心。保藏单位地址:中国.武汉.武汉本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株从蓼科大黄属掌叶大黄活体中分离得到的内生真菌，其特征在于该菌株是腐皮镰刀菌R13?(Fusarium?solani?R13)，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC?NO:?M?2013009。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，游霞，冯甦，于志伟，赵建，侯若彤，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：
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