树状多节孢内生真菌HDFS4-26生物发酵合成紫杉醇及其前体物的分离与纯化方法，它涉及分离与纯化的方法。它为了现有内生真菌生物发酵合成紫杉醇的方法存在发酵液中紫杉醇含量低，紫杉醇前体物回收率低和纯度低的问题。方法：一、菌株活化及种子培养；二、发酵培养；三、分离发酵液和菌丝体并回收，发酵液脱色，萃取，浓缩，得样品；四、一次层析；五、二次层析；六、反相色谱分离，即完成。本发明专利技术发酵液中紫杉醇含量为556.80μg/L，紫杉醇纯度为98％，前体物巴卡亭Ⅲ纯度为97％、三尖杉宁碱纯度为98％；本发明专利技术工艺具有操作流程简单、产物纯度高、溶剂使用量小的特点；同时，间接的降低了紫杉醇的生产成本。
【技术实现步骤摘要】
【技术保护点】
树状多节孢内生真菌HDFS4?26生物发酵合成紫杉醇及其前体物的分离与纯化方法，其特征在于它按以下步骤实现：一、菌株活化及种子培养：将树状多节孢HDFS4?26接种于PDA斜面培养基上，在28℃的条件下活化2～3d，然后将活化后的树状多节孢HDFS4?26接于PDA液体培养基中，在28℃、120r/min摇床培养3d，获得种子培养液；二、发酵培养：将种子培养液以体积比5％的接种量转入改良的S?7液体培养基中，在28℃、120r/min发酵培养12d，其中在发酵培养的第4d补加4g/L的蔗糖和3mL/L的维生素浓缩液，在发酵培养的第6d补加0.4g/L的蛋白胨和0.2mL/L的豆饼水解液，在发酵培养的第7d补加2g/L的蔗糖和20mg/L的肉桂酸，在发酵培养的第9d补加28μg/L的两性霉素B；三、步骤二发酵结束后，分离发酵液和菌丝体并回收，用石油醚对发酵液脱色两次，然后加入等体积的乙酸乙酯和甲醇混合液萃取过夜，分出有机相，再次加入等体积的乙酸乙酯和甲醇混合液萃取过夜，分出有机相，然后合并有机相，再用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯和甲醇，至剩下5mL溶液，将溶液倒入平皿中晾干，获得样品；四、一次层析：将样品按质量体积比1∶10溶解在氯仿中，加入5倍量的硅藻土，拌匀后自然风干，装柱后，依次用氯仿、氯仿∶甲醇＝98∶2、氯仿∶甲醇＝87∶3、氯仿∶甲醇＝90∶10和氯仿∶甲醇＝60∶40进行洗脱，TLC检测，合并含目标产物紫杉醇的馏份，蒸干后，按8mL/g比例溶解在甲醇中，水浴加热到50℃，同时，在搅拌的情况下滴入三分之一甲醇体积的双蒸水，冷却48～72h，获得一次结晶样品；五、二次层析：色谱柱的长径比在8∶1以上，干法装柱，固定相硅胶和一次结晶样品的质量比为30∶1，洗脱模式为己烷/乙酸乙酯60/40(3BV)?55/45(2V)?50/50(5BV)，TLC检测，合并含目标产物紫杉醇的馏份，蒸干后，按8mL/g比例溶解在甲醇中，水浴加热到50℃，同时，在搅拌的情况下滴入三分之一甲醇体积的双蒸水，冷却48～72h，获得二次结晶样品；六、反相色谱分离：以PRP?6树脂为固定相，柱体成型后分别用2BV丙酮、乙酸乙酯、丙酮、20％丙酮?水进行平衡，加入二次结晶样品后，依次用体积含量为20％的丙酮?水体系、体积含量为40％的丙酮?水体系、体积含量为45％的丙酮?水体系、体积含量为50％的丙酮?水体系、体积含量为55％的丙酮?水体系、体积含量为60％的丙酮?水体系和丙酮体系进行梯度洗脱，TLC检测，合并相同溜份，浓缩，结晶，即完成树状多节孢HDFS4?26发酵产紫杉醇及其前体物分离与纯化；其中步骤三中乙酸乙酯和甲醇混合液按照体积比1∶1混合。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵凯，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：
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