绿僵菌破坏素合成相关基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及绿僵菌破坏素合成相关基因及其应用。具体地，本发明专利技术公开了绿僵菌的破坏素合成基因簇(gene?cluster)，所述基因簇包括dtxS1(非核糖体多肽合成酶)、dtxS2(细胞色素P450单加氧酶)、dtxS3(醛酮还原酶)和dtxS4(谷氨酸脱羧酶)等相关基因。本发明专利技术还提供了所述破坏素合成相关基因的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地，涉及绿僵菌破坏素合成相关基因及其应用。
技术介绍
病原真菌与昆虫的互作是昆虫疾病预防和治疗的重要领域。昆虫病原真菌能够产生大量的具有不同生物活性的次级代谢产物，其中包括29种环状的六脂肽类的破坏素(destruxins, dtxs)。破坏素包括一个轻基异己酸(HIC)和五个氨基酸残基(图1)。已知的破坏素可以分为六大类，即dtx A-F及其衍生物。目前还没有一个真菌物种或菌株能够产生所有的破坏素种类。绿僵菌属是主要的破坏素产生菌，绿僵菌属有十几个种，包括寄主广谱的罗伯特绿僵菌和蝗虫专化的蝗绿僵菌。其中，罗伯特绿僵菌能够产生大部分的破坏素成份。此夕卜，白僵菌Beauveria felina,长抱轮枝菌Lecanicillium 1ngisporum和座壳孢类真菌也能一些破坏素，植物病原真菌芸苔链格孢Alternaria brassicae和Ophiosphaerella herpotricha报道能够产生破坏素B(即dtxB)及其衍生物。有研究报道绿僵菌产破坏素的能力与其寄主专化性有关。破坏素能够引起昆虫的细胞毒性，引发昆虫肌肉瘫痪和痉挛，引发的细胞毒性主要原理在于，破坏素作用于钙离子通道及液泡型的ATP酶。除了具有杀虫活性外，破坏素也具有医药功能，对于癌症、骨质疏松症、老年痴呆和乙型肝炎均不同程度的治疗活性。虽然具有杀虫活性的破坏素已于1961年获得鉴定，但负责dtx合成的基因一直不清楚。全人工化学合成破坏素已经有所报道，但是由于破坏素的结构复杂，人工合成的效率极低，且产率很低。综上所述，本领域迫切需要研究绿僵菌破坏素合成相关基因，以便改进破坏素的生产方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供绿僵菌破坏素生物合成的相关基因。本专利技术的另一目的是提供所述基因的功能和应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种对宿主细胞进行改造的方法，包括步骤:(a)测定所述宿主细胞中属于破坏素合成基因簇的各相关基因的表达和/或活性；(b)根据测定结果，向所述宿主细胞中导入破坏素合成基因簇的相关基因，从而提高/恢复所述宿主细胞产生破坏素的能力，其中，所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在另一优选例中，所述的宿主细胞是绿僵菌。在另一优选例中，所述的宿主细胞包括罗伯特绿僵菌、蝗绿僵菌，较佳地，所述的罗伯特绿僵菌是所述破坏素合成基因簇的某一个或多个基因失活、或活性下降的罗伯特绿僵菌。在另一优选例中，当所述基因簇的dtxS4基因失活或活性下降时，还包括步骤:向培养体系中添加β -丙氨酸，以促进破坏素的形成。在本专利技术的第二方面，提供了一种提高罗伯特绿僵菌产生破坏素的能力的方法，包括步骤:向所述的罗伯特绿僵菌中导入破坏素合成基因簇的相关基因，从而提高所述罗伯特绿僵菌广生破坏素的能力，其中，所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在本专利技术的第三方面，提供了一种制备破坏素方法，包括步骤:(i)在适合培养的条件并且在添加丙氨酸的情况下，培养产生破坏素的宿主细胞，从而产生破坏素；和(ii)分离或纯化出所述的破坏素。在另一优选例中，所述的宿主细胞是罗伯特绿僵菌。在另一优选例中，所述的罗伯特绿僵菌是野生型罗伯特绿僵菌、或dtxS4基因失活或活性下降的罗伯特绿僵菌。在另一优选例中，所述的宿主细胞是导入外源破坏素合成相关基因的罗伯特绿僵菌，其中所述的基因选自下组:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在本专利技术的第四方面，提供了一种选自破坏素合成基因簇的相关基因被缺失的罗伯特绿僵菌，其中所述的基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在另一优选例中，所述的罗伯特绿僵菌缺失了所述破坏素合成基因簇的1、2、3或4个基因。在另一优选例中，所述的罗伯特绿僵菌仅缺失dtxS2基因，但不缺失dtxSl基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在本专利技术的第五方面，提供了一种产生B类破坏素的方法，在适合培养的条件下，培养罗伯特绿僵菌，从而产生B类破坏素，其中所述的罗伯特绿僵菌仅缺失dtxS2基因，但不缺失dtxSl基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在另一优选例中，所述的罗伯特绿僵菌是通过对野生型罗伯特绿僵菌进行dtxS2基因敲除而产生的工程菌。在另一优选例中，所述的B类破坏素包括:dtxB、CltxB2、去甲基B。在本专利技术的第六方面，提供了一种绿僵菌，所述的绿僵菌含有导入的、外源的选自破坏素合成基因族的相关基因，其中所述的基因族的相关基因包括一种或多种以下基因:dtxSl基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。在另一优选例中，所述的绿僵菌是罗伯特绿僵菌。在另一优选例中，所述的绿僵菌是可产生破坏素的野生型罗伯特绿僵菌。在另一优选例中，所述的罗伯特绿僵菌含有导入的1、2、3或4个选自所述破坏素合成基因族的基因。在本专利技术的第七方面，提供了一种产生破坏素的方法，在适合培养的条件下，培养本专利技术的第六方面所述的绿僵菌从而产生破坏素。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明下列附图用于说明本专利技术的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本专利技术范围。图1显示了破坏素的结构。图2显示了罗伯特绿僵菌和幢绿僵菌的非核糖体多肽合成酶(nonrobiosomalpeptide synthetase, NRPS)蛋白聚类分析结果，图2A为采用腺苷结构域序列分析罗伯特绿僵菌(基因标记为MAA)和蝗绿僵菌(基因标记为MAC)结果，用黑体标注的结构域对应的基因只存在一种绿僵菌中，即在一种绿僵菌存在则在另一种绿僵菌中不存在；图2B为聚类分析DtxSl的腺苷化A结构域；图2C为聚类分析DtxSl的缩合C结构域。图3显示罗伯特绿僵菌野生型和各种突变型菌株发酵成分分析结果，其中，将作为目标基因进行基因敲除，野生菌株ARSEF 23在萨氏培养中培养一周后，能产生dtx A, dtxB及dtx E等8种破坏素(图3A和图3A’) ；dtxSl为非核糖体多肽合成酶(NRPS)，基因缺失突变株丧失了合成不同破坏素的能力(图3B和图3B’)；dtxS2为细胞色素P450单加氧酶，基因缺失后只产生dtxB等(图3·C和图3C’)；dtxS3为醛酮还原酶，基因敲除后绿僵菌不能合成任何破坏素，但当在其培养基中添加一个轻基异己酸(hydroxyisocaproic acid,HIC)时，突变菌株恢复产生破坏素(图3D和图3D’)；MAA_10046为谷氨酸脱羧酶，即dtxS4，负责将谷氨酸脱基得到β -丙氨酸，为破坏合成的最后一个非正常氨基酸，dtxS4基因敲除后绿僵菌不合成任何破坏素，但当在其培养基中添加β -丙氨酸时，突变菌株恢复产生破坏素(图3Ε和图3Ε’)。注:E-diol为:dtxE 二醇；DtxE为破坏素E ;DtxC为破坏素C ;DtxD为破坏素D ;DtxA为破坏素A ;DtxB2为破坏素B本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对宿主细胞进行改造的方法，其特征在于，包括步骤：(a)测定所述宿主细胞中属于破坏素合成基因簇的各相关基因的表达和/或活性；(b)根据测定结果，向所述宿主细胞中导入破坏素合成基因簇的相关基因，从而提高/恢复所述宿主细胞产生破坏素的能力，其中，所述的基因簇的相关基因包括一种或多种以下基因：dtxS1基因、dtxS2基因、dtxS3基因、和dtxS4基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王成树，王兵，卢玉珍，张四维，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：