新型人工翻译合成系统技术方案

一种新型的人工翻译合成系统，其将结合了特殊氨基酸的tRNA添加到体外翻译系统，基于双重遗传密码表和人工密码子框分割，合成导入了特殊氨基酸的肽。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基于双重遗传密码表和人工密码子框((codon box))分割的新型人工翻译合成系统。本专利技术人等将该方法命名为“柔性体外翻译系统(Flexible In-vitroTranslation system, FIT 系统)，，。
技术介绍
1.翻译合成系统的优点、及其技术上的限制翻译是生物体内普遍进行的蛋白质合成系统，其以编码遗传信息的mRNA作为设计图、由核糖体将20种蛋白质氨基酸依次连接起来，从而准确地合成蛋白质。能够像这样在精确的序列控制下将多种构件(building block)聚合的系统的其它例子并不存在，可以说翻译是我们能够利用的最好的化合物精密合成系统。尤其是，在用于构建肽文库、从其中分离功能性肽的用途时，翻译合成与现有化学合成法相比具有多种优点。翻译反应由于是mRNA序列依赖性的模板合成，因此在由具有随机序列的mRNA(或相应的DNA)进行翻译反应时，可以一气呵成地构建随机肽文库。进而，mRNA能够利用分子生物学方法进行扩增、序列的读取，因此还具有文库化合物的再合成、重叠合(deconvolution)(本技术中，是指对由随机肽文库浓缩的活性肽组进行分组,并对各序列进行测序)也容易的优点。进而，通过与以mRNA展示法为代表的体外展示技术组合，可以直接对作为翻译产物的各个肽用作为其模板的mRNA进行标记。即，对文库中的各肽分子添加能够扩增、读取的标签。由该文库中仅选择与靶蛋白质结合的活性种，通过RT-PCR扩增相应的mRNA再进行翻译，通过重复该操作，能够进行无法利用通常的化学合成文库实施的对进化分子工程的活性肽的选择·和分离。综上，在翻译系统中进行肽文库构建的优点可以列举:I)容易获得丰富的多样性( IO13或其以上)、2)重叠合容易、3)能够进行文库的扩增、4 )能够进行利用体外展示技术的分选法，等。如上所述，核糖体翻译系统能够高效地构建高功能化的肽文库，但另一方面由于其为特化为制造天然蛋白质、肽的机构，因此具有通常仅能合成由20种蛋白质氨基酸构成的多肽这一致命弱点。即，含有在结构、官能团方面具有进一步变化(variation)的“特殊氨基酸”的肽，基本上是无法翻译合成的。本说明书中，“特殊氨基酸”是指所有的与蛋白质中常见的蛋白质氨基酸的结构不同的氨基酸。即，包括蛋白质氨基酸的侧链结构的一部分进行了化学上的变更、修饰而成的非蛋白质氨基酸、人工氨基酸、D型氨基酸、N-甲基氨基酸、N-酰基氨基酸、β-氨基酸等的全部。2.目前为止所报道的改变遗传密码的方法为了克服仅能够合成由20种蛋白质氨基酸构成的肽这样的、核糖体翻译系统的致命弱点，截至目前已经报道了几种改变遗传密码的方法。翻译中的密码子-氨基酸的对应关系即遗传密码是已知的，20种氨基酸的利用受到严格的限定。其概念如下:通过人工改变该对应关系从而能够利用20种以外的氨基酸。被称为遗传密码扩展的方法中，利用天然翻译系统中未被指定氨基酸的终止密码子、人工4碱基密码子，给这些密码子分配蛋白质氨基酸以外的“21号氨基酸”，从而能够进行含有蛋白质氨基酸以外的氨基酸的蛋白质、肽的合成。但是终止密码子、能够利用的4碱基密码子数量有限，因此能够同时利用的非蛋白质氨基酸的数量存在上限(迄今为止所报道的例子中最多为3种，通常为2种或I种)。另一方面，2000年以后，开发了给从系统中去除蛋白质氨基酸而制作的空密码子分配非蛋白质氨基酸的遗传密码重编程法(geneticcode reprogramming method)(基于初始化的改写),该方法能够利用4种以上非蛋白质氨基酸(非专利文献I 3)。但是遗传密码的重编程法也需要去除几种蛋白质氨基酸，因此减少了能够利用的蛋白质氨基酸的种类，具有无法利用全部20种蛋白质氨基酸的缺点。SP，现有的改变遗传密码的方法在能够利用的非蛋白质氨基酸或蛋白质氨基酸的数量方面存在限制，仍不能说是可以自由利用所期望的氨基酸的合成系统。此外，就与天然L-a -氨基酸结构相去甚远的特殊氨基酸(例如D型氨基酸、N-甲基氨基酸)而言，即使利用上述方法分配给空密码子也无法作为底物被翻译系统接受，在肽合成中通常无法引入。即，特殊氨基酸是在通常的翻译系统或现有的改变翻译系统中一般不被弓I入或极难弓I入肽链的氨基酸。现有技术文献 非专利文献非专利文献I:Forester> A.C.et al.:Proc.Natl.Acad.Sc1.USA、Vol.100、p.6353-6357 (2003)非专利文献2: Josephson、K.、Hartman> M.C.、Szostak、J.ff.: J.Am.Chem.Soc.、Vol.127,p.11727-11735 (2005)非专利文献3:Murakam1、H.et al.:Nat.Mathods、Vol.3、p.357-359 (2006)
技术实现思路
专利技术要解决的问题现有的遗传密码的重编程中，通过去除部分蛋白质氨基酸而制作空密码子、分配特殊氨基酸，因此无法使用被去除的蛋白质氨基酸。本专利技术的课题在于，提供在全部的蛋白质氨基酸的基础上能够同时利用多个特殊氨基酸的翻译合成系统。用于解决问题的方案本专利技术人等通过在改变遗传密码方面创新地提出并建立二个新概念，从而完成了原理上能够同时利用40种以上氨基酸的新型人工翻译合成系统(FIT系统)。以下依次说明(I)双重遗传密码、和(2)密码子框的人工分割的概念。1.双重遗传密码天然通用遗传密码表中。一个密码子仅定义I种氨基酸。但是，作为例外，在原核生物的翻译中，AUG密码子在起始反应中指定fMet (甲酰基甲硫氨酸)，在其后的延伸反应中指定Met (甲硫氨酸)。S卩，在起始和延伸中分别严格地定义fMet和Met这样的结构不同的氨基酸。在此，本专利技术人等考虑到其它的密码子是否也同样能够用于起始和延伸两者中、且对应不同的氨基酸。即，提出了如下的“双重遗传密码”的新概念:在延伸用之外，创新地准备了起始反应专用的人工密码子表，使这两者同时发挥作用。天然翻译系统中，仅AUG作为起始密码子发挥作用，与此相对，在双重遗传密码中，AUG以外的多个密码子参加起始反应。进而，这些人工起始密码子可以称为“双义密码子(Dual sense codon)”,即,在起始和延伸反应中各指示二个氨基酸。在使用双重遗传密码的翻译系统中，多个人工起始残基同时发挥作用，因此能够一举合成具有各种N末端结构的肽文库。这与在一个翻译系统中发挥作用的起始残基仅限于一个的现有翻译系统相比可以说是一个大的优点。2.密码子框(codon box)的人工分割双重遗传密码的情况下，起始残基的变化大幅增加，但在延伸反应中利用特殊氨基酸时，也依然会利用几种蛋白质氨基酸，这是必然的。解决该问题的是对密码子框进行人工分割、即遗传密码的重编程。通用遗传密码表中，多个密码子定义同一氨基酸的情况也是存在的。例如，GUN的密码子框完全被Val占据。在密码子框的人工分割的概念中，将这一密码子框分割成二个，一方面指定原来的蛋白质氨基酸而另一方面则定义其它的特殊氨基酸。原理上，该翻译系统在延伸反应中除了天然20种氨基酸外还能够同时利用11种之多的特殊氨基酸。3.将双重遗传密码表和人工密码子框分割组合而成的新型人工翻本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：菅裕明，村上裕，后藤佑树，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，
类型：
国别省市：