生殖系干细胞的宿主外成熟制造技术

本发明专利技术提供了使未成熟生殖系细胞宿主外成熟为单倍体配子用于在需要其的患者中恢复生育力的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及下述体系，所述体系使来自由于损伤其生殖系干细胞(germlinestem cell)而处于生育力风险的患者的生殖系干细胞在宿主外部或宿主外成熟(在代用(surrogate)动物体内或体外)成熟并在稍后的日子恢复患者的生育力。如果使用针对恶性肿瘤的化学疗法或放射疗法治疗此类患者,则宿主外成熟以及随后的体外受精和子宫植入是必要的；并且由于担忧可能再引入肿瘤细胞而污染原来移植的睾丸或卵巢组织，将避免直接再植入或自体移植回宿主患者。_4]
技术介绍
生殖系干细胞存在于繁殖器官即卵巢和睾丸中，它们潜在地代表哺乳动物体内最重要、最受保护的干细胞种类之一。已报道了在得自这些组织的干细胞中的遗传保守和高端粒酶活性，以及由染色质染色体修饰的广泛的DNA修饰。科学家们对于成年繁殖组织中存在何种干细胞以及它们在分化中的潜能持不同观点。化学疗法和放射治疗不但以癌细胞为目标，还以快速分裂细胞为目标。在睾丸中，快速分裂的生殖细胞对这些暴露是高度敏感的。在青春期前的睾丸中，生殖系干细胞同样敏感并在放射暴露后严重地剂量依赖性地衰竭。低剂量的细胞毒性药物或辐射使分化的精原细胞衰竭，而较不敏感的精原干细胞以及精母细胞和精细胞可存活。分化中的生殖细胞可继续它们的成熟成为精子细胞，并可用产生于存活的干细胞群的干细胞再定殖(re-colonize)生 精小管(seminiferous tubule)。然而，在严重衰竭的情况下，精子生成仅可在非常少的生精小管中恢复，从而限制生育力。在睾丸干细胞全部衰竭后患者会永久性的不育。对精子生成的影响在青春期时或之前表现得最严重，因为精子典型地不能在青春期后雄性中获得和冷冻保存。如果给予足够的时间重新开始精子生成，甚至少数干细胞可再定殖生精小管。直到最近，人们相信，包括人类的大多数哺乳动物物种的雌性性腺，容纳有封在原始卵泡内的有限数目的减数分裂-停止的生殖细胞(卵母细胞)，其作为在每个月经周期期间排卵时释放的卵的储备库存。通过多种机制包括细胞凋亡，卵母细胞数目在出生后生命期间减少，其被广泛认为最终导致卵巢不再含有生殖细胞。人类中，卵母细胞储备耗尽典型地在生命的第五个十年期间发生，而推动绝经。根据这些基本的繁殖生物学理论，人们还认为，一旦衰竭，卵巢生殖细胞库不能再补充。因此，加速卵母细胞损失的任何治疗对生育力下降有危险并会在比期望的更早的年龄引起绝经。例如，女性暴露于损伤卵巢的广范围的试剂(例如化疗剂和放射疗法)，通常导致过早绝经和不可逆的不孕。目前，在各种不利条件下保存生育力和正常卵巢功能的有限的治疗选择(例如，冷冻保存卵巢组织碎片或单个卵母细胞)是侵入性的并通常需要在先的激素疗法，这对许多患有激素反应性肿瘤的女性而言可能是医学上不适当的。而且，目前没有能推迟绝经期的正常卵巢衰退的治疗选择。已发现了针对在雄性和雌性二者中恢复功能性生殖细胞的两种主要途径。第一种是在存活的组织上嫁接(graft)未成熟组织(卵巢或睾丸)的组织碎片，第二种以干细胞的分离和移植为基础。生殖细胞移植已在啮齿动物模型中开发。将来自小鼠或密切相关物种的生殖细胞显微注射进小鼠的生精小管再次刺激了从供体精原干细胞的精子生成。在转移之前，精原细胞可被冷冻保存或培养。类似地，冷冻保存的卵巢皮质组织已在绵羊和人类中移植，引起发情恢复并在正常交配后产生活的后代。然而，此类自体直接移植回供体生物体对原来被治疗恶性肿瘤的患者而言可能不是最佳的。这是因为如果此类患者在化学疗法或放射疗法后复发，不清楚复发是否来自化学疗法或放射疗法没被杀死的体内恶性细胞贮主(reservoirs)或是否冷冻保存的性腺组织和细胞的再移植包含了此类恶性细胞。因此，针对此类患者的最佳途径是使冷冻保存的性腺组织成熟为功能性精子或卵，并用天然的或类似地宿主外成熟的亲本的卵或精子进行体外受精(有或没有胞质内精子注射或ICSI)，然后将受精的胚胎再移植进雌性亲本。该途径没有肿瘤污染的任何可能性，因为受精的胚胎仅从未污染的宿主外成熟的精子或卵形成。因此,需要人类的生殖系细胞储存系统(banking system),以恢复没有能力储存成熟的精子或卵子的患者的繁殖潜能并使储存的生殖系细胞宿主外/半体内或宿主外/体内成熟来产生成熟的精子或卵子。
技术实现思路
本公开提供了使未成熟的生殖系干细胞成熟来产生成熟的繁殖细胞的方法。在本文公开的一种实施方式中，提供了使未成熟的生殖系细胞宿主外成熟为单倍体配子的方法，其包括下述步骤:从睾丸或卵巢中获得未成熟生殖系细胞；并在模仿细胞借以体内成熟的条件的条件下，体外培养未成熟生殖系细胞，其中所述培养引起未成熟生殖系细胞成熟为功能性精子或卵母细胞。在另一种实施方式中，未成熟生殖系细胞从青春期前患者中获得。在另一种实施方式中，未成熟生殖系细胞在成熟之前被冷冻保存。在另一种实施方式中，未成熟生殖系细胞是生殖系干细胞或减数分裂前生殖细胞。在一种实施方式中，培养包括在人工生精小管中培养未成熟睾丸生殖系细胞。在另一种实施方式中，培养包括在存在选自胶质细胞源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子和表皮生长因子的组的至少一种生长促进因子的情况下培养未成熟睾丸生殖系细胞。在另一种实施方式中，培养包括在存在选自促卵泡激素、干细胞因子和维甲酸的组的至少一种成熟-诱导因子的情况下培养未成熟睾丸生殖系细胞。在另一种实施方式中，人工生精小管包括涂有细胞外基质的生物相容性管。在另一种实施方式中，细胞外基质是辜丸细胞外基质。还在另一实施方式中，辜丸细胞外基质对睾丸生殖系细胞而言是自体的。在一种实施方式中，培养包括在存在颗粒细胞和纤维蛋白凝块的情况下培养未成熟卵巢生殖系细胞。在另一种实施方式中，培养包括培养在存在生长促进因子(包括胶质细胞源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子和生长激素)的情况下被培养的未成熟卵巢生殖系细胞。还在另一实施方式中，培养包括培养在存在成熟诱导因子(包括促卵泡激素、干细胞因子和维甲酸)的情况下被培养的未成熟卵巢生殖系细胞。在另一种实施方式中，纤维蛋白凝块对卵巢生殖系细胞而言是自体的。在另一种实施方式中，颗粒细胞对卵巢生殖系细胞而言是自体的。附图简沭附图说明图1描绘了使用流式细胞计量术从转基因0G2小鼠中分离的睾丸干细胞GFP(绿色荧光蛋白)阳性亚群的富集。GFP表达指出的Oct-4阳性细胞在与野生型(图1A)比较的新生(图1B)和成年(图1C)0G2小鼠二者中作为不同的细胞群体被发现。在Oct-4阳性细胞中，发现由c-Kit阳性(R5)和c-Kit阴性(R2)组成的两种清晰的亚群(图1D-1E)。还展示了 GFP和c-Kit表达之间的关联(图1F-1H)。图2描绘了培养物中专能生殖细胞(mGC)系发育期间的形态改变。在培养前于细胞制备物中观察小鼠0ct-4+/GFP+细胞(图2A ;箭头；第1-3天)。培养后不久观察到Oct-4的下调(图2B;第3-7天)。在培养第二周细胞黏附后，发生明显的形态改变(图2C第7-15天；图2D第15-20天)。培养约三周后，形成含有小圆细胞的集落(图2E ;第20-30天)。培养约一个月后观察到Oct-4的上调(图2F ;第30-40天)。图2G-1中分别展示了来自于新生0G2、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.05 US 61/258,5351.使未成熟生殖系细胞宿主外成熟为单倍体配子的方法，其包括下述步骤: 从睾丸或卵巢中获得未成熟生殖系细胞；并 在模仿所述细胞在原宿主体内成熟的条件的条件下在原供体的外部在代用动物体内或体外培养所述未成熟生殖系细胞，其中所述培养引起所述未成熟生殖系细胞成熟为功能性精子或卵母细胞。2.根据权利要求1的方法，其中所述未成熟生殖系细胞获得自青春期前患者。3.根据权利要求1的方法，其中所述未成熟生殖系细胞在成熟之前被冷冻保存。4.根据权利要求1的方法，其中所述未成熟生殖系细胞是生殖系干细胞或减数分裂前生殖细胞。5.根据权利要求1的方法，其中所述培养包括在人工生精小管中培养未成熟睾丸生殖系细胞。6.根据权利要求1的方法，其中所述培养包括在存在选自由胶质细胞源性生长因子、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子和表皮生长因子组成的组的至少一种生长促进因子的情况下培养未成熟睾丸生殖系细胞。7.根据权利要求1的方法，其中所述培养包括在存在选自...

【专利技术属性】
技术研发人员：法里波茨·伊扎德亚尔，周永强，康斯坦斯·袁，
申请(专利权)人：普里梅真生物技术DBA瑞坡司铁有限责任公司，周永强，
类型：
国别省市：