本发明专利技术涉及通过聚乙二醇的介导将致诱变核碱基引入植物原生质体的改进的诱变方法。具体而言，本发明专利技术涉及在植物细胞原生质体中定向改变双链受体DNA序列的方法，其包括将双链受体DNA序列与供体致诱变核碱基结合，其中双链受体DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，其中供体致诱变核碱基相对于要改变的双链受体DNA序列，优选相对于第一DNA序列包含至少一个错配，其中该方法进一步包括使用聚乙二醇（PEG）介导的转化将供体致诱变核碱基引入细胞原生质体中的步骤以及使用PEG原生质体转化以增加定向诱变率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及通过将单链DNA寡核苷酸致诱变核碱基引入细胞而在靶细胞中的DNA特定位点上特异性和选择性改变核苷酸序列的方法。更特别地，本专利技术涉及通过使用聚乙二醇(PEG)将致诱变核碱基引入植物原生质体的定向诱变的方法。本专利技术进一步涉及含有致诱变核碱基和PEG的试剂盒。本专利技术还涉及PEG用于增强定向诱变的用途。
技术介绍
有意地在活细胞的遗传物质中产生改变的过程具有修饰所述细胞或生物体(所述细胞形成该生物体的一部分或能够再生形成该生物体)的一个或多个遗传编码的生物学特征的目的。这些改变可以采取下列形式:删除部分遗传物质、添加外源性遗传物质或改变遗传物质的已有核苷酸序列。人们知道改变真核生物遗传物质的方法已经有20多年，所述方法在植物、人和动物细胞和微生物中有广泛的应用，用于农业、人类健康、食品质量和环境保护领域中的改进。最常见的方法由向细胞的基因组中加入外源性DNA片段组成，这将赋予所述细胞或其生物体优于或超过已有基因所编码的性质的新性质(包括其中已有基因的表达将因此被抑制的应用)。虽然许多这样的例子在获得所需性质中是有效的，然而这些方法不是十分精确，因为对外源性DNA片段插入至基因组的位置没有控制(因而对最终的表达水平没有控制)，并且因为所需的效果必须通过优于原始的和平衡良好的基因组所编码的天然性质表现出来。相反，引起预先确定的基因组位点中的核苷酸的添加、删除或转换的定向诱变的方法将允许精确地修饰已有的基因。另外，由于定向诱变的精确特性，可以预料的是以此方式获得的新型植物系将更易于被消费者接受。定向诱变是一种定点诱变的方法，其基于将合成的致诱变核碱基(由以其Watson-Crick碱基配对性质与DNA相似但在化学上可以不同于DNA的短串核苷酸样部分(moietie)组成)递送进入真核细胞核(Alexeev和Yoon NatureBiotechnol 16: 13431998 ; Rice Nature Bi o techno 1.j_￡: 321，2001; Kmi ec，J.Cl in.1nvest.112:632.2003)。一旦被引入细胞，这样的致诱变核碱基在靶位点上与互补序列碱基配对。通过有意地在核碱基中设计错配，该错配可以在靶基因组序列中的相应位置上引起核苷酸转换。该方法允许在内源性位点上转换单个核苷酸或最多几个核苷酸，但是可以应用于在已有位点上产生终止密码子，从而引起其功能的破坏，或产生密码子改变，从而产生编码具有改变的氨基酸组成的蛋白的基因(蛋白工程)。在植物、动物和酵母细胞中已经描述了定向诱变。两类不同的合成性致诱变核碱基已经用于这些研究:嵌合的DNA = RNA核碱基或单链核碱基。嵌合的DNA: RNA核碱基(嵌合体)是自我互补的分子，其由25bp只有DNA的区域和25bp的互补序列(由5bp的DNA的核心区形成，所述DNA两侧是IObp的2’ -O-甲基化的RNA，其被认为可以帮助嵌合体在细胞中的稳定性)组成。5bp核心区在其中心包括工程化的错配，其带有在基因组的靶DNA序列中要改变的核苷酸。这两个区都通过4bp的胸腺嘧啶脱氧核苷发夹连接。当引入细胞时，认为嵌合体与其靶序列形成双D-环，在嵌合体和靶核苷酸之间形成错配。然后该错配由内源性细胞DNA修复蛋白通过转换基因组核苷酸而解决。第一个使用嵌合体的定向诱变的例子来自于动物细胞(见Igoucheva等人2001GeneTherapy8, 391-399的综述)，然后后来还用于获得植物细胞中的定向诱变(Beetham等人 1999Proc.Natl.Acad.Sc1.USA並:8774-8778; Zhu 等人 1999Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96, 8768-8773; Zhu 等人 2000Nature Biotech.18，555-558; Kochevenko 等人 2003PlantPhvs.132:174-184:Okuzaki 等人 2004Plant Cell Rep.22:509-512) 与人细胞不同，产生定向诱变事件的植物细胞可以再生成完整的植物，并且突变可以转移至下一代，使其成为重要食品作物的研究和商业化诱变的理想工具。但是，许多实验室的深层次研究显示使用嵌合体的定向诱变频率相当低并且是可变的，或甚至不能检测到(Ruiter等人2003PlantMol.Biol.53, 715-729, Van der Steege 等人(2001)Nature Biotech.丛:305-306)，并且依赖于这样的因素:如靶标的转录状态、细胞在细胞周期中的位置、靶标的序列和嵌合体的质量(其是难以合成的)。由于使用本领域中已知方法的定向诱变的频率相对较低，所以只有当基因组靶标的单个核苷酸的改变引起显性可选择性表型时，这样的事件才可以被检查至IJ。在植物细胞中，将特异性的点突变引入乙酰乳酸合成酶(ALS，在玉米中是AHAS)基因的开放阅读框中，所述基因催化合成支链氨基酸亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的共同最初步骤。在烟草中，单个核苷酸的改变足以产生密码子转换P194Q或W571L。在这些密码子转换后产生的ALS蛋白对磺酰脲类除草剂的抑制不敏感，因此提供了选择染色体基因座上的单个核苷酸转换的方法。由于使用用嵌合体工作的困难，人们已经寻求更可靠的可替代的寡核苷酸设计。几个实验室已经研究了单链(ss)核碱基进行定向诱变的能力。发现它们给出更加可重复的结果、合成更简单并且还可以包括修饰的核苷酸以改进致诱变核碱基在细胞中的表现(Liu 等人 2002Nucl Acids Res30:2742-2750;review, Parekh-Olmedo 等人 2005Gene Therapyl2:639-646;Dong 等人 2006Plant Cell Rep.25:457-65;De Pi6doue 等人200701igonucIeotides 27:258-263)。在Kmiec 的多个专利申请(其中有 W00173002, W003/027265, W001/87914, W099/58702，W097/48714，W002/10364)中已经描述了定向诱变。在W001/73002中考虑到的是:使用未修饰的核碱基获得的基因改变的低频率相信主要是由于其被存在于反应混合物或靶细胞中的核酸酶所降解。为了解决这一问题，提出掺入经修饰的核苷酸以赋予所产生的核碱基对抗核酸酶的抗性。这种经修饰的核苷酸的典型例子包括硫代磷酸酯键或2’ -O-甲基-类似物。这些修饰优选位于核碱基的末端，留出包围定向碱基的中心未修饰的结构域。为了支持这个观点，专利申 请W002/26967显示某些增加核碱基细胞内寿命的经修饰的核苷酸可以增加定向诱变在体外测试系统中也在哺乳动物染色体靶标上的效率。不只是核酸酶抗性，ss致诱变核碱基结合至其互补靶DNA的亲和力也具有显著增加定向诱变频率的潜力。含有经修饰的增加结合亲和力的核苷酸的ss核碱基可以更有效地在复杂基因组中发现其互补的靶标和/或结合至其靶标更长的时间并且被调节DNA转录和复制的蛋白除去的可能性更低。体外定向诱变分析已经用于测试许多经修饰的核苷酸以增加诱变过程的效率。锁定的核酸(LNA)和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在植物细胞原生质体中定向改变双链受体DNA序列的方法，其包括将双链受体DNA序列与供体致诱变核碱基结合，其中双链受体DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列并且其中供体致诱变核碱基相对于要改变的双链受体DNA序列，优选相对于第一DNA序列包含至少一个错配，其中该方法进一步包括使用聚乙二醇（PEG）介导的转化将致诱变核碱基引入细胞原生质体中的步骤。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：P·邦道克，M·T·J·德博特，F·吕西耶，
申请(专利权)人：凯津公司，
类型：发明
国别省市：
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