本发明专利技术公开了一种与肾上腺脑白质营养不良症相关的基因突变、检测该突变所使用的引物、探针、抗体和试剂盒。本发明专利技术为检测肾上腺脑白质营养不良症提供了一种新的方式。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及与肾上腺脑白质营养不良症相关的基因突变、检测该突变所使用的引物、探针、抗体和试剂盒。
技术介绍
肾上腺脑白质营养不良(adrenoleukodystrophy, ALD)是一种遗传性疾病，其特点是进行性弥漫性脑白质硬化，伴有肾上腺皮质功能减退。X染色体连锁性的ALD是最常见的一种类型，其临床表现具有高度异质性。ALD儿童患者仅见于男性，进行性神经性失能，10岁前发病，平均发病年龄7.2+/-1.7岁(2.75-10岁)，3岁前多数发育正常，无精神运动障碍。86%病例先出现神经系统症状，其中85%对ACTH兴奋显示皮质醇分泌不足，追问病史曾有不能解释的恶心、呕吐、脱水、无力、皮肤色素沉着等肾上腺皮质功能减退的表现，早期的神经精神症状表现为情绪不稳定，学习成绩不良，继而快速发展为顶颞叶功能障碍，语言辨别能力和实体觉丧失，体全觉差；1/3早期病例视觉丧失,约1/3有全身性和局限性癫痫，短期内成为植物人(1.9+/-2年)。青春期ALD，起病介于10-21岁，症状类似儿童ALD，但进展慢，表现类似AMN，常伴有性功能障碍。通常，该疾病的可靠诊断是培养纤维母细胞中显示极长链饱和脂肪酸(VLCFAS)浓度增高。产前诊断可作羊膜穿刺细胞培养，但VLCFAS检查技术上极其困难。CT扫描和MRI有较大价值，病变部位显示低密度，造影剂加强后低密度区邻近有花环状造影剂堆积。MRI较CT扫描更具有诊断价值。分子生物学研究表明，X连锁性ALD是由于位于X染色体长臂28区的AB⑶I基因发生突变。AB⑶I基因由10个外显子和9个内含子组成，编码区序列长度为2238个碱基(如SEQ ID N0.1所示)。AB⑶I基因编码的跨膜转运蛋白包括745个氨基酸(如SEQ IDN0.2所示)，该蛋白的作用是将长链脂肪酸转运至过氧化物酶体。当AB⑶I基因发生突变时，其编码的蛋白的一级序列可能发生改变，从而无法正常发挥作用，造成极长链饱和脂肪酸在脏器堆积，导致发病。目前国内外均有多个中心可对AB⑶I基因进行基因突变的检测，已发现400多种基因突变类型可导致X连锁隐性ALD，但大多数家系都具有同一种特殊的基因型。不同家系的表现型差异很大，这一特征与各种修饰基因或其它一些尚未了解清楚的因素有关。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种导致肾上腺脑白质营养不良症的ABCDl基因的突变，并提供能够检测该突变的引物、探针、抗体、试剂盒等，从而为诊断肾上腺脑白质营养不良症提供一种新的方式。本专利技术的第一个方面是提供一种AB⑶I基因突变体，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。所述基因突变体是ABCDl基因的编码序列第657、658位的胞嘧啶缺失所形成的。专利技术人通过基因测序的方法对ALD病患进行检测，发现该病患的AB⑶I编码基因第657、658位胞嘧啶缺失，该位点位于ABCDl基因的第一外显子中。进一步分析其家庭成员的AB⑶I基因序列，病患父亲的AB⑶I基因正常，病患母亲的AB⑶I基因为杂合子，是该突变的携带者，但母亲没有发病。该突变是首次在中国ALD病患中发现，之前未见文献报导，为检测和判断ALD病患提供一种新的方式。本专利技术提供的基因突变体或包括缺失位点的基因突变体片段可以作为分子标记，在检测ABCDl编码基因是否存在突变时作为标准，供相关人员分析。在一种优选的实施方式中，所述包括缺失位点的ABCDl基因突变体片段包含SEQID N0.3中的至少10个连续核苷酸，并且所述至少10个连续核苷酸包含SEQ ID N0.3的第656、657、658位核苷酸。这样的基因突变体片段的长度可以是10-700个核苷酸，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650 等任意长度。在一种优选的实施方式中，所述包括缺失位点的ABCDl基因突变体片段是上述片段的反向互补序列。由于本专利技术的ABCDl基因突变体缺失了两个胞嘧啶，导致其编码的氨基酸序列发生变化，无法翻译出能够行使正常功能的跨膜转运蛋白，从而导致发生ALD。因此，本专利技术的第二个方面是提供一种多肽，所述多肽具有如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列，所述氨基酸序列由SEQ ID N0.3的核苷酸序列编码。将该基因突变体编码 的氨基酸序列(SEQ ID N0.4)与正常AB⑶I基因编码的氨基酸(SEQ ID N0.2)进行比对可见，由于本专利技术的基因突变体核苷酸序列中缺失对应于正常AB⑶I基因编码序列的第657、658位核苷酸，使得其编码的氨基酸序列(SEQ ID N0.4)从第220位起开始发生变化，并且第299位氨基酸由组氨酸变成终止密码子。该基因突变体所编码的蛋白质无法实施正常跨膜蛋白的转运功能。同样，本专利技术提供的多肽或多肽片段可以作为分子标记，用于在检测该跨膜蛋白是否存在突变时作为对照品。在一种优选的实施方式中，所述多肽片段包括SEQ ID N0.4的第220位至第298位中的至少10个连续氨基酸。所述多肽片段的长度可以是1(T298个氨基酸。在进一步优选的实施方式中，所述多肽片段是PGRG⑶FLHPASGGP (SEQ ID N0.11)。本专利技术的第三个方面是提供能够扩增出SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸的引物，利用所述引物通过测序的方法检测ABCDl基因的序列。设计引物的原则包括:(I)可以扩增出SEQ ID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸(S卩，ABCDl基因编码序列的第657、658位核苷酸)；(2)在核酸序列的保守区内设计，同时需要具有特异性；(3)利用所述引物扩增出的产物不能形成二级结构；(4)引物长度一般在15 30个碱基；(5)G+C含量为40% 60% ； (6)引物与靶序列作用的Tm值以60°C左右最佳；(7)碱基要随机分布；(8)单向引物自身不能有连续4个碱基互补；(9)双向引物之间不能有连续4个碱基互补；(10)引物5'端可以修饰；(11)引物3'端不可修饰；(12)引物3'端要避开密码子的第3位。在一种优选的实施方式中，本专利技术提供的扩增引物是:上游引物:ABCD1-F:5，-CCACGCCTACCGCCTCTACTT-3，(SEQID N0.5)；下游引物:ABCD1-R:5’-AGACTGTCCCCACCGCTC-3’(SEQ ID N0.6)。利用弓丨物扩增-测序方法检测ABCDl基因的步骤是本领域技术人员公知的。例如，采集待测样本的血液，提取DNA ; WDNA为模板，利用本专利技术提供的引物进行扩增；对得到的产物进行测序分析；将所得的序列与正常的ABCDl基因序列比较，判断待测样本中的ABCDl基因是否存在第657、658位核苷酸缺失。本专利技术的第四个方面是提供能够检测SEQ ID勵.3所示序列的第657、658位核苷酸(即，ABCD1基因编码序列第657、658位核苷酸)的探针。本领域技术人员已知，通过杂交的方法，利用探针是否能够与待测序列(如基因或基因片段或扩增产物)结合来检测待测序列是否存在变异。本领域中已知有多种利用探针检测序列的方法。在已知检测位点是ABCDl基因编码序列第657、658位核苷酸缺失的情况下，本领域技术人员能本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ABCD1基因突变体，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种AB⑶I基因突变体，其核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。2.—种AB⑶I基因突变体片段，包含SEQ ID N0.3中的至少10个连续核苷酸，并且所述至少10个连续核苷酸包含SEQ ID N0.3的第656、657、658位核苷酸；或者是其反向互补序列。3.根据权利2所述的基因突变体片段，其特征在于，所述基因突变体片段用作检测SEQ ID N0.3的第657、658位核苷酸的探针；优选地，所述基因突变体片段是5， -AGCCACTTGGACGT-3，。4.用于扩增SEQID N0.3所示序列的第657、658位核苷酸的引物；优选地，所述引物是: 上游引物:ABCD1-F:5’ -CCACGCCTACCGCCTCTACTT-3’ ； 下游引物:ABCD1-R:5，-AGACTGTCCCCACCGCTC-3，。5.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。6.一种多肽片段，包括SEQ ID N0.4的第220位至第298位中的至少10个连续氨基酸；优选地，所述多肽片段的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈子江，高媛，高选，黄色新，曹永芝，王谢桐，
申请(专利权)人：国家辅助生殖与优生工程技术研究中心，
类型：发明
国别省市：
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