本发明专利技术涉及一种文昌鱼细胞核内蛋白及其表达基因与应用，文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因，核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示；该文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin，氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明专利技术所述的表达基因有助于从理论上提高对免疫系统构成和免疫应答机制的认识，为在基因水平生产开发新的海水养殖抗寄生虫疫苗奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种文昌鱼细胞核内蛋白及其表达基因与应用，特别是一种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白Akirin及其表达基因与应用，属于基因工程
技术介绍
NF-κΒ是一个重要的转录因子，其在免疫调控、炎症反应、应激反应及细胞凋亡中起着重要作用，因此一直是研究的热点(Brian et al.，2009)。作为转录因子，NF-κ B如何在庞大的kB结合位点中特异的识别结合所需的靶基因，仍然是NF-K B信号通路研究的热点和难点。入核后的NF-κ B需要多个辅助因子包括Akirin，Nurrl，SIRT6等共激活因子，协助NF-K B共同调节靶 基因的表达(Wang et al.，2010)。所以了解这些辅助转录因子的调节机制可以帮助我们更好的认识NF- K B信号通路。Akirin是2008年发现的一个在昆虫和脊椎动物都高度保守的核内蛋白。最早在果蝇的Imd信号通路中发现，可以协助NF-κ B调节靶基因表达。果蝇中的Akirin可以参与应答革兰氏阴性菌的Imd信号通路，也同时可以参与肌肉发生，而小鼠中具有Akirin的两个同源基因(Akirinl/2), Akirinl被证明与肌肉的发生有关,而Akirin2则和果蚬中的Akirin 一样，参与NF-κ B的信号通路。目前关于Akirin的各项功能机制都研究甚少。以上研究都暗示了 Akirin在功能上的保守性。正因为此保守性，Akirin目前正被很多研究学者研究开发成一种广谱性的疫苗去抗寄生虫的感染，尤其是针对蜱虫等对人畜、养殖产业伤害较大的寄生虫感染。我国拥有漫长的海岸线，海水养殖业的发展对于国民经济的可持续发展具有重要意义。然而，多年来病害严重地妨碍着海水养殖业的迅速发展。由于文昌鱼既具有脊椎动物的基本特征，又具有许多无脊椎动物的特征。研究文昌鱼的免疫防御机制和对病原感染应答的规律，能够为阐明海水养殖动物免疫防御机制提供资料，为开发海水养殖的病害控制新方法提供思路，为养殖水产动物病害的免疫防治技术提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种文昌鱼细胞核内蛋白及其表达基因与应用。术语说明1.PCR技术:链式聚合酶反应，利用DNA聚合酶，模板，引物以及dNTP进行体外扩增特定DNA片段的技术。2.⑶D分析软件:NCBI网站上提供的一种用来推测和分析特定氨基酸序列形成的结构域信息的软件。3.原位杂交:运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。4.实时荧光定量PCR:在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。本专利技术技术方案如下:—种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因，核苷酸序列如SEQ IDN0.1 所示。一种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。一种重组载体，插入了 SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。该重组载体由质粒pcDNA3.1载体插入·SEQ ID N0.1所示核苷酸序列获得,该表达载体购自美国Clontech公司。一种重组细胞，转入了上述SEQ ID N0.1所示核苷酸序列或上述重组载体。该重组细胞由人胚肾细胞系HEK293T转入了上述SEQ ID N0.1所示核苷酸序列或上述重组载体获得。上述在文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因在生产开发新的海水养殖抗寄生虫疫苗中的应用。本专利技术的文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因是从青岛沙子口取材的成年文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)的总 RNA 中，用 TIANGEN 的第一链反转试剂盒反转出第一链cDNA当做模板，用佛罗里达文昌鱼同源序列设计引物，利用PCR技术从青岛文昌鱼转录组中克隆获得的。经对该基因的核苷酸序列进行测定，测序结果表明所获DNA片段含有801个核苷酸，开放阅读框架为660个核苷酸，该开放阅读框架即是编码细胞核内蛋白Akirin基因Akirin,共编码219个氨基酸,命名为AmphiAkirin。该细胞核内蛋白AmphiAkirin不具备已知的功能域,无DNA和RNA结合位点，具有两个入核信号肽，是文昌鱼Akirin基因豕族尚未报道的一条基因序列。有益效果1、本专利技术获得的海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因可以表达细胞核内蛋白AmphiAkirin，有助于从理论上提高对免疫系统构成和免疫应答机制的认识，为在基因水平生产开发新的海水养殖抗寄生虫疫苗奠定基础。2、本专利技术所述的细胞核内蛋白AmphiAkirin在成体文昌鱼各组织中广泛分布以及在细菌冲击成体文昌鱼后表达出现上调，从而暗示了其在先天免疫中发挥作用的可能。可以为海水养殖的病害控制提供新的方法和思路，尤其是在防治细菌类的浸染方面提供理论依据。 3、本专利技术所述的细胞核内蛋白AmphiAkirin可以激活NF- κ B信号通路，可以为病害的免疫防治技术提供理论依据和基因来源。附图说明图1、青岛文昌鱼 Branchiostoma belcheri tsingtauense 成体总 RNA 的电泳图；其中:1、DNA分子量标记(marker)，2、3、4、5青岛文昌鱼成体总RNA图2、通过PCR扩增克隆的编码细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因片段的电泳图；其中:1、扩增的DNA片段；2、DNA分子量标记(marker)；图3、成体原位杂交技术检测AmphiAkirin在各组织中的分布；A:AmphiAkirin在文昌鱼成体中的分布；B:AmphiAkirin在神经管中的分布；C:AmphiAkirin在觸、肝盲囊等消化道部位的分布；D:对照。图4、实时荧光定量PCR技术分析细菌免疫冲击后细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达量的柱状图；A:大肠杆菌刺激下，AmphiAkirin在表皮中的表达量；B金黄色葡萄球刺激，AmphiAkirin在表皮中的表达量；图5、双荧光素酶报告基因检测细胞核内蛋白AmphiAkirin激活NF-κ B报告基因表达量的柱状图。具体实施例方式下面结合说明书附图和实施例对本专利技术的技术方案做进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。实施例1青岛文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin编码基因的克隆:1.1青岛文昌鱼总RNA的提取以及第一链cDNA的合成(提取合成步骤参照Takara和TIANGEN公司的相关试剂盒说明书)。I)将IOOmg新鲜组织(文昌鱼成体)剪碎放入预1.5mlep管中。2)加入ImlTrizol (购自Invitrogen公司)试剂,用研磨件快速研磨组织至无大的组织块，室温静置5min，使组织充分裂解。此时样品可放入_80°C长期保存。3)每ImlTrizol试剂加入0.2ml的三氯甲烷(氯仿)，加盖封严，剧烈震荡15s，室温静置15分钟。4) 4°C, IOOOg,离心15min。此时样品分为三层:下层的红色有机相，中间层及上层水相，RNA即留在上层水相中。5)将上层水相转移如一干净的离心管中。6)在水相本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因，核苷酸序列如SEQ?IDNo.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin的表达基因，核苷酸序列如SEQ IDN0.1 所示。2.—种海洋模式生物文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。3.一种重组载体，插入了 SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，该重组载体由pcDNA3.1载体插入SEQIDN0.1所示核苷酸序列获得。5.一种重...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯力骏，闫杰，荆韧威，李开霖，刘凯兴，张妍，董璇，王建峰，张长青，孔雨，刘欢欢，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。