本发明专利技术涉及基因工程及发酵工程领域，具体公开了一种利用基因重组酵母混合培养将纤维素转化为乙醇的方法。该方法是利用基因工程技术构建能分别分泌表达内切葡聚糖酶EG、外切葡聚糖酶CBH和β-葡萄糖苷酶BGL的三种基因重组酿酒酵母菌株，然后将上述三种基因重组酵母菌株混合培养，并以纤维素原料为唯一碳源发酵，可较高效地将纤维素直接转化为乙醇。本发明专利技术方法将产酶、纤维素水解和乙醇发酵在一个体系中完成，不需额外添加纤维素酶，可在发酵过程中直接分解纤维素并转化为乙醇，省略了糖化步骤，简化了操作，节省了成本，是一套绿色环保低碳的纤维素乙醇生产工艺。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程及发酵工程领域，更具体地，涉及。
技术介绍
木质纤维素是自然界中含量最丰富的可再生资源，是植物组织构成的主要成分，占植物干重的20-45%。自然界中的木质纤维素由植物通过光合作用产生，而其中近90%尚未被人类有效利用，大部分被作为废料处理，不仅要耗费大量的人力物力，而且造成了环境污染和极大的浪费。木质纤维素原料主要由纤维素、半纤维素以及木质素构成。如果能充分利用其中的纤维素和半纤维素生产生物燃料乙醇，既可以保护环境，又能解决国际性的能源危机问题，同时能产生巨大的经济效益。纤维素是一种由葡萄糖组成的高分子多糖结构，其酶解需要多个纤维素酶的协同作用完成，主要包括三类纤维素酶:内切葡聚糖酶(endoglucanase, EG)、外切葡聚糖酶,又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase, CBH)和 β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase, BGL)。EG能随机地切断纤维素长链内部的β-1，4-糖苷键，形成纤维寡糖；CBH则与EG分工，能作用于纤维素分子的结晶区，水解纤维素链末端的β_1，4-糖苷键，依次切下纤维二糖分子；而BGL则能将EG和CBH水解形成的纤维寡糖和纤维二糖继续水解为葡萄糖。最终获得的葡萄糖可被微生物发酵利用，如用酿酒酵母等可以将纤维素水解产生的葡萄糖发酵成为乙醇。目前纤维素乙 醇的生产工艺主要有以下几种:(1)分步糖化发酵(s印aratehydrolysis and fermentation, SHF)0 SHF使水解和发酵分步进行。优点是酶解和发酵可在各自的最优条件下进行而不互相影响，缺点是酶解过程中积累的葡萄糖和纤维二糖会对纤维素酶产生末端产物抑制，从而影响酶的活力，同时操作复杂。⑵同步糖化发酵(simultaneous sacchari cation and fermentation, SSF)和同步糖化共发酵(simultaneous sacchari cation and co-fermentation, SSCF)0 SSF 是纤维素的酶解和乙醇发酵同步进行，酶解产生的葡萄糖同时被微生物转化成乙醇；SSCF是在SSF的基础上，使其发酵所用的微生物菌种(单菌种或混合菌种)能同时利用己糖和戊糖，故称为共发酵。SSF和SSCF解除了纤维素酶的末端产物抑制，提高了酶解效率，同时简化了生产工艺、缩短了生产周期，且已经被证明其效果优于SHF。但是SSF和SSCF工艺中糖化和发酵的条件采用折中的方法，糖化和发酵都不在最优条件下进行，并且SSF和SSCF的糖化步骤通常采用商业酶，纤维素酶的成本和酶解效率是其大范围工业化应用的阻碍因素。⑶统合生物工艺(consolidated bioprocessing, CBP)。Lynd 等于 2005 年提出了 CBP 的概念，即在不额外添加商业酶的情况下，由一种或几种微生物在一个反应器来完成纤维素的糖化和乙醇的发酵的工艺过程。对于需要添加商业酶的SHF、SSF和SSCF而言，CBP显著地降低了生产成本。有报道表明，以硬木的粉末为原料，采用CBP的乙醇转化效率比SSF高四倍，且生产成本更低。虽然酶分离纯化技术的日益进步，SSF中使用的商业酶价格较前几年已经明显下降，但是CBP这一新的工艺因其一体化的优点，仍然具有无可比拟的优势。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供。本专利技术所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现: ，包括如下步骤: 51.种子液的制备:首选分别构建能分泌表达内切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表达外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表达β -葡萄糖苷酶(BGL)的菌株AS2.489-PS-BGL ;然后活化培养各菌株至对数生长期，并使各菌株的酵母细胞数达到0.8^1亿/mL，即为成熟种子液； 52.配制发酵培养基并灭菌，所述培养基含有如下重量份的组分:100100份蔗渣，2(Γ40份玉米浆(液态， 购自华润赛力事达玉米工业有限公司)，1(Γ30份葡萄糖，5 15份硫酸铵，f 10份磷酸二氢钾； 53.接种:将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的成熟种子液混合后，于无菌条件下接种，总接种量为培养基体积的8 15% ； 54.发酵:前酵期通入无菌空气，控制温度为28 32°C，搅拌速度为15(Γ250转/分钟，搅拌培养:Γ5小时，前酵期结束；然后进入主酵期厌氧发酵阶段，主酵期保持温度为28^32° C，停止通气并保持5(Γ100转/分钟的缓慢搅拌，发酵2 4天；整个发酵过程中控制pH为3.5 4.5。作为一种优选方案，S3所述的接种是将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的成熟种子液按I 5:Γ5:Γ5的体积比混合。作为一种进一步优选方案，S3所述的接种是将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的三级种子液按I 3:Γ3:Γ3的体积比混合。作为一种最优选方案，S3所述的接种是将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的三级种子液按1:3:2的体积比混合。作为一种优选方案，S3所述的接种量为培养基体积的12%。作为一种优选方案，培养基含有如下重量份的组分:12(Γ180份蔗渣，25 30份玉米浆，15 20份葡萄糖，5 10份硫酸铵，2飞份磷酸二氢钾。作为一种最优选方案，培养基含有如下重量份的组分:150份蔗渣，28份玉米浆，18份葡萄糖，7份硫酸铵，4份磷酸二氢钾。作为一种优选方案，上述培养基中的蔗渣(甘蔗渣)经机械粉碎至15(Γ250目。作为一种优选方案，S4中前酵期控制温度30° C，搅拌速度为200转/分钟，搅拌培养4小时；主酵期保持温度为30° C，发酵3天。作为一种优选方案，S4整个发酵过程中控制pH为4.0。本专利技术所述的AS2.489-PS-EG的构建方法参见文献:刘泽寰，台艳，唐根云，全艳彩，王峻梅，肖文娟，龚映雪.绿色木霉EG III基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达.中山大学学报(自然科学版)，2009, 48(6): 83-88.,即本专利技术所述的AS2.489-PS-EG是通过所述文献中的制备方法制备得到的菌种。本专利技术所述的AS2.489-PS-CBH的构建方法参见文献:刘泽寰，全艳彩，唐根云，龚映雪，肖文娟，王峻梅.绿色木霉CBH II基因的克隆及在酿酒酵母中的表达.华南理工大学学报(自然科学版)，2009, 37(6): 91-95.，即本专利技术所述的AS2.489-PS-CBH是通过所述文献中的制备方法制备得到的菌种。本专利技术所述的AS2.489-PS-BGL的构建方法参见文献:刘泽寰，唐根云，全艳彩，龚映雪，肖文娟，王峻梅.绿色木霉BGLI基因在酿酒酵母中的克隆、表达及其纤维素乙醇发酵.兰州大学学报(自然科学版)，2009, 45(3): 61-66.即本专利技术所述的AS2.489-PS-BGL是通过所述文献中的制备方法制备得到的菌种。本专利技术具有如下有益效果:(I)本方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用基因重组酵母混合培养将纤维素转化为乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.种子液的制备：首选分别构建能分泌表达内切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489‑PS‑EG、能分泌表达外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489‑PS‑CBH和能分泌表达β‑葡萄糖苷酶BGL的菌株AS2.489‑PS‑BGL；然后活化培养各菌株至对数生长期，并使各菌株的酵母细胞数达到0.8~1亿/mL，即为成熟种子液；S2.配制发酵培养基并灭菌，所述培养基含有如下重量份的组分：100~200份蔗渣，20~40份玉米浆，10~30份葡萄糖，5~15份硫酸铵，1~10份磷酸二氢钾；S3.接种：将AS2.489‑PS‑EG、AS2.489‑PS‑CBH和AS2.489‑PS‑BGL的成熟种子液混合后，于无菌条件下接种，总接种量为培养基体积的8~15%；S4. 发酵：前酵期通入无菌空气，控制温度为28~32°C，搅拌速度为150~250转/分钟，搅拌培养3~5小时,前酵期结束;然后进入主酵期厌氧发酵阶段,主酵期保持温度为28~32°C，停止通气并保持50~100转/分钟的缓慢搅拌，发酵2~4天；整个发酵过程中控制pH为3.5~4.5。...
【技术特征摘要】
1.一种利用基因重组酵母混合培养将纤维素转化为乙醇的方法，其特征在于，包括如下步骤:子液的制备:首选分别构建能分泌表达内切葡聚糖酶EG的菌株AS2.489-PS-EG、能分泌表达外切葡聚糖酶CBH的菌株AS2.489-PS-CBH和能分泌表达β -葡萄糖苷酶BGL的菌株AS2.489-PS-BGL ;然后活化培养各菌株至对数生长期，并使各菌株的酵母细胞数达到0.8^1亿/mL，即为成熟种子液；制发酵培养基并灭菌，所述培养基含有如下重量份的组分:100100份蔗渣，20^40份玉米浆，10^30份葡萄糖，5 15份硫酸铵，Γ10份磷酸二氢钾；种:将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH 和 AS2.489-PS-BGL 的成熟种子液混合后，于无菌条件下接种，总接种量为培养基体积的8 15% ；酵:前酵期通入无菌空气，控制温度为28 32°C，搅拌速度为15(Γ250转/分钟，搅拌培养:Γ5小时，前酵期结束；然后进入主酵期厌氧发酵阶段，主酵期保持温度为28^32° C，停止通气并保持5(Γ100转/分钟的缓慢搅拌，发酵2 4天；整个发酵过程中控制pH为3.5 4.5。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S3所述的接种是将AS2.489-PS-EG、AS2.489-PS-CBH和AS2.489-PS-BGL的...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘泽寰，林蒋海，胡佳，黎惠忠，李晶博，龚映雪，肖文娟，
申请(专利权)人：广州分子生物技术有限公司， 暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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