细胞培养容器及使用该容器的细胞培养方法技术

孔的一对侧面中的一个侧面通过气体透过膜与第1流路的一部分区间相接，另外一个侧面通过气体透过膜与第2流路的一部分区间相接。在孔内填充了细胞培养液的状态下，通过用第1流路和第2流路相互流通特定成分浓度不同的高浓度气体和低浓度气体，从而在孔内形成特定成分的浓度分布。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞培养容器及使用该容器的细胞培养方法
本专利技术涉及具有用于细胞培养的孔并用于在该孔内形成适合细胞培养的环境的细胞培养容器和使用该容器的细胞培养方法。这样的细胞培养容器例如用于通过模拟生物体内的微环境来分析细胞功能和药剂对细胞的功效。
技术介绍
在生物体内的正常组织中，由血管供给充分的氧和营养。与此相对，一般认为，在肿瘤组织内，由于没有与癌细胞的增殖相应的血管新生以及各血管结构无序且脆弱等，因而氧或营养处于低浓度状态。关于癌与氧或营养的低浓度的关系，一直以来被探讨，最近研究尤其更为活跃。作为目前为止得到的知识已知，例如一部分癌细胞获得了在低氧浓度区域中的耐性（例如参考非专利文献1）。此外，非专利文献1中，作为干细胞壁龛（niche）的重要要素之一而列举了低氧浓度的同时，还揭示了癌细胞通过低氧浓度变为癌干细胞“样”。这样，作为详细考察癌的功能的途径之一，低氧浓度状态下的癌细胞培养就变得很重要，有必要再现癌细胞所生存的环境。目前，细胞培养一般是在能够保持温度37℃、水蒸气饱和、约5%CO2状态的培养器内进行的。培养器内的氧浓度基本与大气中的相同，为20%左右。此外，用低氧浓度状态进行研究时，使用能够将氧浓度保持在0.7%或约5%的所谓低氧浓度状态的特别的培养器。然而，认为：在离血管较远的癌细胞或在例如形成为10个以上的一定大小的块的癌细胞群的周边微环境中，在氧浓度上具有梯度。特别是关于从骨髓内朝向骨的方向，认为骨深部的氧浓度基本为0%，因而认为在同方向上存在氧浓度梯度。因此，为了培养癌细胞，有必要制作出具有低氧浓度区域内的氧浓度梯度的环境。然而，即使想在以前的细胞培养中通常使用的培养皿、烧瓶或者孔板（wellplate）等容器中形成氧浓度梯度，由于这些容器容积大、而且存在作为热源的碳酸气培养器、显微镜照明灯、荧光灯和其它电器等，因而发生以热对流为主要原因的液体（此处为培养基）的移动，不能稳定地制作出具有氧浓度梯度的环境。与此相对，在被称作μTAS（microTotalAnalysissystem）或微小流体控制技术（microfluidics）的研究领域中，使用应用了微细加工技术而制备的微小容器（例如容积为1μL以下）。认为如果将容器内的容积设得很微小，液体就被困在微小空间的密闭体系中，受周围的壁的影响较大，不易流动，即使有热源，对流的发生也被抑制。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利特表2004-508571号公报非专利文献非专利文献1：実験医学Vol.25,No.14,P2139-2143,2007（实验医学Vol.25,No.14,P2139-2143,2007）非专利文献2：島津評論66[1·2]37～44（2009.9）（岛津评论66[1·2]37～44（2009.9））
技术实现思路
专利技术所要解决的课题作为使用上述微小容器制作特定成分的浓度梯度的方法，一般的方法是如专利文献1所示的那样使不同浓度的多个液体一边流动一边相接触的方法。然而，将这种方法转用到细胞培养上时，由于细胞培养液一直处于流动状态，因此会发生如下问题：细胞因细胞培养液的流动而受到某些压力（stress）、或细胞周边微环境的液性因子随细胞培养液的流动而流失、变成与实际的细胞周边环境不同的环境。而且，微小容器的孔的上表面等多由PDMS（聚二甲基硅氧烷）形成。由于PDMS是气体透过性的，因此如果是通常的细胞培养，则对在孔内维持与培养器内同样的各气体分压而言是有效的。然而，由于孔内通过PDMS膜与培养器内处于平衡状态，因此形成如低氧浓度区域中的氧浓度梯度这样的浓度梯度是很困难的。由于以上情况，还不能在细胞培养液不流动的状态下制作出具有低氧浓度区域中的氧浓度梯度的环境。因此，无论是模拟肿瘤周边的微环境，还是稳定地并以良好的再现性培养与癌干细胞具有同样的行为的细胞，还是取出变为癌干细胞样的癌细胞，都很困难。而且，由于在白血病的研究中也不能维持低氧浓度区域中的氧浓度梯度，因此也不能模拟骨髓内微环境。为此，本专利技术的目的在于能够稳定地制作出以氧和二氧化碳等为代表的气体的、具有适于细胞培养的浓度区域的环境。用于解决课题的手段本专利技术的细胞培养容器包括：孔、第1流路和第2流路，所述孔形成于基体内部，具有容纳细胞的空间，与使细胞培养液流通的流路相连，空间的相对的一对侧面中的一个侧面由允许气体透过而不允许液体透过的第1气体透过膜形成，一对侧面中的另一个侧面由允许气体透过而不允许液体透过的第2气体透过膜形成；所述第1流路通过第1气体透过膜与孔相接，使含有特定成分的气体流通；所述第2流路通过第2气体透过膜与孔相接，流通不含特定成分或与第1流路中流通的气体相比含有低浓度的特定成分的气体。对本专利技术的细胞培养容器的孔体积进行考虑。在该孔中优选以其原本的规模模拟生物体内的微环境。此处，作为用于测定细胞和组织的功能的最小单位，对细胞进行考虑。如果把细胞近似地看做直径为R的球，为了观测2个细胞间的相互作用，孔底面需要排列2个细胞，最小成为直径为2R的圆以上的大小。如果将细胞径设为10μm，最小也成为直径20μm的圆。如果高度有必要为细胞2倍的话，则最小体积为6.3×10-6mm3。另一方面，如果考虑最大体积，则为1mm×1mm×1mm=1mm3左右。如果比该体积大，细胞间就会过分分开，不能观察到相互作用。由此，孔优选具有从6.3×10-6mm3至1mm3之间的容积。即使在该最大体积，液体也被困在微小空间的密闭体系中，受周围的壁的影响较大，不易流动，对流的发生被抑制。实际上，实验时是不流动的状态，交换培养液时等的流速也充其量在10μm/sec左右。即使假设流速偏离10mm/sec级别而发生大的液体流动，雷诺数（Re）比从层流向乱流转变的2300还要充分地小，成为层流，因此孔内液体被扩散所左右而被混合。也就是说，可以稳定地维持孔内形成的环境。优选封闭孔的上下表面的上下表面封闭部中的至少一个形成为可从外部目视确认孔内部的透明窗。这样的话，就可以使用显微镜等从外部确认培养细胞的位置和状态等。此时，可在该透明窗的内表面固定随接触液中的氧浓度而改变光学性质的氧监测物质。这样的话，就可对孔中形成的氧浓度分布进行光学测定。这样的细胞培养容器也可作为用于检证孔中的氧浓度梯度的测试块（testchip）而利用。作为“氧监测物质”，例如可以使用铂卟啉等荧光色素。关于使用了铂卟啉等的氧浓度分布的测定，将在实施例中详述。本专利技术的细胞培养方法是包括如下步骤进行细胞培养的方法：使用本专利技术的细胞培养容器中封闭基体的孔上下表面的上下表面封闭部中的至少一个形成为可从外部目视确认孔内部的透明窗的细胞培养容器，在孔中填充细胞培养液并同时导入细胞的步骤；通过透明窗识别导入到孔中的细胞在孔内的停留位置的步骤；根据第1流路及第2流路的气体流量与孔内形成的特定成分的浓度分布之间的预先求得的关系，设定第1流路及第2流路的气体流量以使细胞的停留位置处的特定成分的浓度为规定浓度的步骤；和使孔内的细胞培养液保持静止的状态下，以在上述气体流量设定步骤中设定的气体流量在第1流路及第2流路中流通气体的步骤。作为在孔内形成浓度梯度的对象的特定成分，可以列举氧。此时，孔内的氧浓度优选小于21%。这样的话，就可在孔内制作出近似本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.08 JP 2010-2006791.一种细胞培养容器，包括：孔，所述孔形成于基体内部，具有底面和侧面，具有容纳细胞的空间，与流通细胞培养液的流路相连，载置有细胞的所述底面为平面状，所述空间的相对的一对侧面中的一个侧面由允许气体透过而不允许液体透过的第1气体透过膜形成，所述一对侧面中的另一个侧面由允许气体透过而不允许液体透过的第2气体透过膜形成，所述孔是将细胞培养液以与所述第1气体透过膜、所述第2气体透过膜、上表面以及所述底面接触的密闭状态填充的孔；第1流路，所述第1流路通过所述第1气体透过膜与所述孔相接，流通含有特定成分的气体；和第2流路，所述第2流路通过所述第2气体透过膜与所述孔相接，流通不含特定成分或与所述第1流路中流通的气体相比含有低浓度特定成分的气体，根据流通所述第1流路的气体与流通所述第2流路的气体之间的所述特定成分的浓度差，在所述孔内的细胞培养液中的沿着所述底面的平面内形成所述特定成分的稳定的浓度梯度。2.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，所述孔具有从6.3×10-6mm3到1mm3之...

【专利技术属性】
技术研发人员：务中达也，阿部浩久，叶井正树，明地将一，前川平，木村晋也，芦原英司，庄子习一，川合健太郎，
申请(专利权)人：株式会社岛津制作所，国立大学法人京都大学，学校法人早稻田大学，
类型：
国别省市：