本发明专利技术提供了一种以磷脂酰丝氨酸为靶点的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV，膜联蛋白AnnexinV?的羧基端连有半胱氨酸Cys，半胱氨酸的巯基上标记有放射性核素99Tcm。可采用直接标记法对Cys-AnnexinV进行99Tcm标记，步骤包括：（1）取适量的SnCl2加入Cys-AnnexinV使蛋白亚锡化；（2）向步骤（1）蛋白亚锡化后的Cys-AnnexinV中加入99TcmO4-，混匀后放置，即形成99Tcm-Cys-AnnexinV。本发明专利技术所用标记方法更为简便实用，且能尽可能保持标记蛋白活性和生物功能，用于进行放射性核素显像，检测各种疾病中细胞凋亡发生的程度和范围，尤其是作为显像剂在检测细胞凋亡和血栓中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于放射性核素标记
,具体涉及一种99Tcm-Cys-AnnexinV标记化合物及其标记技术和作为显像剂在急性心肌损伤、肿瘤疗效评价以及急性血栓探测方面的应用。
技术介绍
细胞凋亡(apoptosis)是一种高度保守的细胞程序性死亡(P⑶)，在诸多生理和病理过程中起着重要的作用。过 度凋亡会使组织功能丧失，如急性心肌梗死、慢性心力衰竭、移植排斥反应、中风、神经系统变性疾病等。相反，系统性红斑狼疮及类风湿关节炎以凋亡不充分为特征，使免疫细胞大量存活而不恰当地杀死和破坏正常组织，使组织脏器功能受损。凋亡抑制导致细胞过度增殖和肿瘤形成，许多化疗药物多是通过诱导凋亡来实现治疗目的的。但目前常规的细胞凋亡检测方法还不能满足基础研究和临床实践的需要，已有的实验室检测手段只能从细胞形态学和生化改变方面进行体外的定性和定量分析，如电镜观察、流式细胞分析、DNA降解条带分析和相关蛋白表达水平检测等。在活体条件下观察细胞凋亡范围、时相和发展速度等，一直是研究的一大难题。特别是在心血管系统疾病的研究中，活体标本采集尤为困难，因此活体显像显得更为必要。近年来，国内外已开展有关细胞凋亡放射性核素显像的研究，研究的关键是合成能与凋亡细胞特异结合的显像剂，且物理化学特性适于放射性核素标记，并具有血液清除快，靶器官显像清晰等特点。放射性核素标记磷脂结合蛋白V (Annexin V)是目前最受关注的细胞凋亡显像剂之一。Annexin V是一种人体内源性蛋白，属于Ca2+依赖性磷脂结合蛋白家族，最早是从胎盘中分离出来，具有一些抗凝固及抗炎的作用，曾被作为一种抗凝剂研究。染色体定位分析显示，Annexin V是由位于人的第4条染色体4q26_q28上的Annexin V基因编码,含有319个氨基酸，包括个70-80氨基酸重复单元，分子量约为35kD。研究证实，Annexin V能与凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸(PS)特异性结合，正常细胞的PS位于细胞膜内层，凋亡时表达在细胞膜外层，是细胞凋亡的特征性标志，Annexin V与PS的亲和力高达10_9mol/L。Annexin V类显像剂的合成关键是放射性核素的标记，既要获得较高的放射化学纯度，同时又不能损伤Annexin V的结合活性。目前研究最成功的是99Tcm标记的AnnexinV(99Tcm-Annexin V)。99Tcm具有优良的物理性质，且获取容易，价格低廉。目前采用99Tcni标记Annexin V有多种方式1.双功能鳌合剂法。使用双功能鳌合剂法选择连接剂非常重要，既要保证与99Tcm有很高的配位能力，又要保证不改变其原有生物活性。常用的有二硫二氮(N2S2)、乙二胺半胱氨酸(EC)、BTAP等，其中以肼基烟酰胺(Hynic)最为多见。目前，多数临床前研究采用Hynic为螯合剂进行99Tcm标记Annexin V,得到的99Tcm-Hynic-Annexin V比活度较高,放射性化学纯度大于90%，并且已经在凋亡动物模型中获得良好的评估，被认为是监控肿瘤治疗疗效潜在的有效的放射性药物。但双功能鳌合剂法过程比较复杂，对技术条件要求严格，制备成本闻。2.直接还原标记法 直接还原标记法相对于双功能鳌合剂法更为简便、理想，以往的研究认为以SnCl2为还原齐U、中性PH条件下，可得到标记率高(>95%)、稳定性好(>10h)的99Tcm-AnnexinV标记产物，且易于药盒化，但由于99Tcm与AnnexinV中的巯基相结合,会使AnnexinV的活性会受到影响，产生一些变性蛋白，使肝脏的放射性摄取增加。3.对Annexin V进行结构修饰 国外 Tait JF 等学者(Tait JF, Brown DS, Gibson DF, Blankenberg FG, StraussHW. Development and characterization of annexin V mutants with endogenouschelation sites for 99mTc. Bioconjug Chem 2000; 11:918 - 25)通过修饰Annexin V的结构，在Annexin V的N端延长了 7个氨基酸(含一个或两个半胱氨酸残基)形成变异分子Annexin V116、117和118,三种蛋白可在大肠杆菌细胞质中表达并可纯化成同质体,与红细胞膜上的PS都有较高的亲和力。用在Annexin V上加肽序列的方法，使之形成了与99Tcm结合的内生螯合位点。以SnCl2为还原剂，葡庚糖酸盐(GH)为转换剂，三种蛋白可特异性结合99Tcm至少1850 3700MBq (50 IOOmCi)，且标记后性质稳定，保持了与膜PS的亲和力。
技术实现思路
为克服已有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种标记方法更为简便实用，且能尽可能保持标记蛋白活性和生物功能的标记化合物，用于进行放射性核素显像，检测各种疾病中细胞凋亡发生的程度和范围。 为达到上述目的，本专利技术的技术方案具体如下 一种以磷脂酰丝氨酸为祀点的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV,膜联蛋白AnnexinV的羧基端连有半胱氨酸Cys，半胱氨酸的巯基上标记有放射性核素Tc'上述放射性药物为无色透明液体针剂。本专利技术还提供了一种上述放射性药物99Tcn1-Cys-AnnexinV的标记方法，采用直接标记法对Cys-Annexin V进行99Tcm标记,步骤包括 (1)取适量的SnCl2加入Cys-AnnexinV使蛋白亚锡化； (2)向步骤(I)蛋白亚锡化后的Cys-AnnexinV中加入99Tcm04_,混勻后放置，即形成99Tcm-Cys-Annexin V。上述的放射性药物99Tcn1-Cys-AnnexinV的标记方法，可以具体为 (1)取适量的SnCl2·2Η20，以浓度为O. 05mol/L的HCl溶解，取已配制好的上述含SnCl2的ΙΟΟμ ，总计亚锡量约25 3(^g依次加入Cys-Annexin V 5 5(^g后充分摇匀； (2)向步骤(I)蛋白亚锡化后的Cys-AnnexinV中加入99Tcm04_0. 8mL, 10mg/mL维生素C IOOPL,混勻后放置，即形成 99Tcm-Cys-Annexin V。本专利技术还提供了一种99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于检测心肌缺血损伤后心肌细胞凋亡即探测急性心肌损伤方面的用途。本专利技术还提供了一种99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于化疗后检测肿瘤细胞凋亡即肿瘤化疗后疗效评价方面的用途。本专利技术还提供了一种99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于探测活化血小板水平即检测急性血栓方面的用途。本专利技术所述的99Tcm-Cys-AnnexinV显像剂采用了一种新的Annexin V衍生物Cys-Annexin V作为99Tcm标记的底物,首次采用直接标记法实现了 Cys-Annexin V的99Tcm标记，由于本专利技术技术方案中99Tcm仅对AnnexinV羧基端的Cys上的巯基进行了标记，避开Annexin V的结合单位和功能区,保护膜联蛋白的生物学功能。本专利技术技术方案不仅保持了膜联蛋白的活性本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以磷脂酰丝氨酸为靶点的放射性药物99Tcm?Cys?AnnexinV，其特征在于膜联蛋白AnnexinV?的羧基端连有半胱氨酸Cys，半胱氨酸的巯基上标记有放射性核素99Tcm。
【技术特征摘要】
1.一种以磷脂酰丝氨酸为靶点的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV,其特征在于膜联蛋白AnnexinV的羧基端连有半胱氨酸Cys,半胱氨酸的巯基上标记有放射性核素99Tcm。2.如权利要求1所述的放射性药物，其特征在于所述放射性药物为无色透明液体针剂。3.—种如权利要求1所述的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV的标记方法,其特征在于采用直接标记法对Cys-Annexin V进行99Tcm标记,步骤包括 (1)取适量的SnCl2加入Cys-AnnexinV使蛋白亚锡化； (2)向步骤(I)蛋白亚锡化后的Cys-AnnexinV中加入99Tcm04_充分混匀后放置，即形成 99Tcm-Cys-Annexin V。4.如权利要求3所述的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV的标记方法,其特征在于所述步骤(2)还加入维生素C保持溶液稳定性。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：王峰，华子春，胡敏进，方纬，王自正，
申请(专利权)人：南京市第一医院，华子春，江苏靶标生物医药研究所有限公司，中国医学科学院阜外心血管病医院，
类型：发明
国别省市：
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