公开了一种光学分析技术，其可使用发光探针检测试样溶液中的靶颗粒的状态或性质，所述试样溶液具有低浓度或数密度的所述靶颗粒。所述光学分析技术使用可检测来自溶液微小区域中的光的光学系统如共焦显微镜或多光子显微镜光学系统，从而在改变试样溶液中微小区域的位置时(即，在借助微小区域扫描试样溶液时)，检测来自结合至靶颗粒的发光探针的光，结果，单独检测穿过微小区域的颗粒，使得能够计数所述颗粒并获得所述颗粒的浓度或数密度的信息。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及光学分析方法，其通过使用可检测源自溶液中的微小区域的光的光学系统如共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统，在诸如分散或溶解于溶液中的原子、分子或其聚集体(下文中，这些称为“颗粒”)例如生物分子如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或这些的聚集体、病毒和细胞等粒状对象，或者非生物颗粒的状态(相互作用、结合或解离状态等)的分析中获得有用信息，更具体地，涉及借助发光探针进行溶液中粒状对象的检测、其浓度或其数密度的测定等的方法。具体而言，在本说明书中，“发光探针”为通过荧光、磷光、化学发光、生物发光、光散射等发光，并结合至要成为观测对象物的颗粒以能够观测所述颗粒的物质。
技术介绍
根据近年来光学测量技术的发展，通过使用共焦显微镜光学系统和能够计数光子 (单一光子检测)的超高灵敏光检测技术已变得能够在单一光子或单一荧光分子水平下检测和/或测量微光。因此，存在借助此类微光测量技术进行生物分子等的分子间相互作用、结合或解离反应的检测的各种提议的装置或方法。例如，在借助激光共焦显微镜光学系统和光子计数技术的突光相关光谱学(fluorescence correlation spectroscopy, FCS,参见例如专利文献I和2和非专利文献1-3)中，对进出试样溶液的微小区域(显微镜的激光集中的聚焦区域，称为“共焦体积(confocal volume)”)的荧光分子或荧光标记的分子(荧光分子等)的荧光强度进行测量，并基于由所测量的荧光强度的自相关函数值来确定的荧光分子等的平均滞留时间(dwell time)(平移扩散时间)和微小区域中滞留分子数的平均值，实现了信息如荧光分子的移动速度、大小或浓度等的获得，和/或各种现象如分子结构或大小的变化、分子的结合或解离反应或者分散和凝集的检测。另外，在荧光强度分布分析(Fluorescence Intensity Distribution Analysis, FIDA,例如专利文献3)或光子计数直方图(Photon Counting Histogram, PCH,例如专利文献4)中，生成有与FCS类似测量的进出共焦体积的荧光分子等的荧光强度的直方图，通过将统计学模型公式拟合(fitting)为直方图的分布来计算荧光分子等的固有亮度的平均值和滞留在共焦体积中的分子的平均数，从而基于这些信息，可估计分子的结构或大小的变化、结合或解离状态或分散和凝集状态。此外，在专利文献5和6中，提出了基于使用共焦显微镜光学系统测量试样溶液的荧光信号的时间经过(time progress)来检测突光物质的方法。专利文献7已提出了通过光子计数技术测量从流经流式细胞仪的荧光细颗粒或固定在基板上的荧光细颗粒的微光以检测流路中或基板上荧光细颗粒的存在的信号计算处理技术。特别地，根据采用使用共焦显微镜光学系统和光子计数技术如FCS和FIDA对微小区域的荧光测量技术的方法，测量所需的试样量可极小(用于一次测量的量至多几十μ L)，与现有技术相比其浓度极低，测量时间也大幅缩短(在一个实施方案中，重复几次时间为秒级的测量过程)。因此，期望这些技术，特别是在进行通常用于医学或生物学研究和开发领域中的稀有或昂贵的试样的分析时，或在进行如病的临床诊断或生物活性物质筛选等的大量试样的试验时，与常规生物化学方法相比，能够以低成本和/或快速地实验或检查的强有力的工具。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利特开2005-098876专利文献2 日本专利特开2008-292371专利文献3 日本专利4023523专利文献4 W02008-080417专利文献5 日本专利特开2007-20565专利文献6 日本专利特开2008-116440专利文献7 日本专利特开平4-337446 非专利文献非专利文献 I Masataka Kaneshiro; “Protein, Nucleic acid, Enzymelo1. 44，Nο.9，1431-1438 页，1999非专利文献 2 F.J.Meyer-Alms; “Fluorescence CorrelationSpectroscopy” edt. R. Rigler, Springer, Berlin, 204-224 页,2000非专利文献 3 :Noriko Kato, et al. “Gene medicine”，Vol. 6，No. 2，271-277 页非专利文献 4 S . Sando and E. T. Kool, J. Amer. Chem.Soc,2002，Vol. 124，2096-2097 页
技术实现思路
专利技术要解决的问题简言之，在上述光学分析技术如FCS、FIDA和PCH中，通过统计程序来计算所测荧光强度的时间波动的量级，然后基于波动量级确定进出试样溶液中的微小区域的荧光分子等的各种特性。因此，为了获得上述光学分析技术的显著性结果，可优选将要成为试样溶液中的观测对象物的荧光分子等的浓度或数密度制备为在平衡状态下时长为秒级的一次测量中，使能够进行统计学处理的数量的荧光分子等进出微小区域，优选使约一个荧光分子等总是存在于微小区域中(典型地，由于共焦体积的体积约为lfL，可优选荧光分子等的浓度约为InM以上。)。换言之，当试样溶液中观测颗粒的浓度或数密度远远低于能够进行统计学处理的水平(例如，远低于InM)时，将发生在测量中观测对象物很少进入微小区域的状态，因此，荧光强度的测量结果将包括长期在微小区域中根本没有观测对象物存在的状态，以及显著荧光强度的观测量将减少，因而在基于如上所述荧光强度的统计学波动的光学分析技术中不能期望显著或精确的分析结果。在记载于专利文献5和6中的使用共焦显微镜的光学系统检测荧光物质的方法中，在不进行如上所述的荧光强度波动的统计学处理的情况下，试样中观测的荧光分子等的存在与否可由几秒的测量中具有显著强度的荧光信号产生与否来确定，并公开获得具有显著强度的荧光信号的频率与试样中荧光分子等的数量之间的关系。特别地，在专利文献6中，教导搅动试样溶液内部的不规则流动的产生改善了检测灵敏度。然而，即使在那些方法中，也只是检测通过扩散或不规则流动而随机进入微小区域的荧光分子等的存在，而不能掌握微小区域中的荧光分子等颗粒的行为，因此，例如还未实现颗粒计数或颗粒的浓度或数密度的定量计算。此外，专利文献7中所记载的技术为单独检测在流式细胞仪的流路(flow)中的荧光细颗粒或固定在基板上的荧光细颗粒的存在，而不是检测颗粒如通常状态下溶解或分散在试样溶液中的分子和胶体，即在试样溶液中随机运动的颗粒的技术，因此，还未实现定量计算出溶解或分散在试样溶液中的颗粒的浓度或数密度。另外，由于专利文献7的技术包括例如在流式细胞仪中测量或将荧光颗粒固定在基板上的处理的方法，试验所必需的试样量与光学分析技术如FCS、FIDA和PCH相比大幅增加，并且对进行试验的人员可要求复杂高级的操作技术。然后，为了在进行光学分析技术如FCS、FIDA和PCH时不使用统计学处理，由此实现在要观测颗粒的浓度或数密度低于前述光学分析技术中所使用的水平的试样溶液中观测的颗粒的状态或特性的检测。本申请的申请人在日本专利申请2010-04714和PCR/JP2011/53481中的新原本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.26 JP 2010-1673381.一种光学分析方法，其通过使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统来检测来自结合至在试样溶液中分散并随机运动的颗粒的发光探针的光从而检测所述颗粒，所述方法的特征在于包括以下步骤制备包含所述颗粒和所述发光探针的试样溶液，通过改变所述光学系统的光学通路而在所述试样溶液中移动所述光学系统的光检测区域的位置；在所述试样溶液中移动所述光检测区域的位置时，检测来自所述光检测区域的光；和在所述检测光中单独检测来自已结合至各所述颗粒的所述发光探针的光信号，从而单独检测所述颗粒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于进一步包括以下步骤对所述单独检测的颗粒的数量计数，从而对移动所述光检测区域的位置的过程中所检测的所述颗粒的数目计数。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述移动光检测区域的位置的步骤中，所述光检测区域的位置以预设的速度移动。4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，在所述移动光检测区域的位置的步骤中，所述光检测区域的位置以比已结合至所述颗粒的所述发光探针的扩散移动速率快的速率移动。5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，在所述单独检测来自已结合至各所述颗粒的所述发光探针的所述光信号从而单独检测所述颗粒的步骤中，基于检测的时间序列光信号的形状来检出一个颗粒进入所述光检测区域。6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述制备所述试样溶液的步骤包括从所述试样溶液中分离未结合至所述颗粒的发光探针的步骤。7.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述制备所述试样溶液的步骤包括使吸收来自所述发光探针的光的受体与未结合至所述颗粒的所述发光探针结合的步骤。8.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述发光探针为当所述发光探针结合至所述颗粒时其发光特性改变的物质，和所述检测光为从已结合至所述颗粒的所述发光探针发出的光。9....
【专利技术属性】
技术研发人员：田边哲也，中田秀孝，叶梨拓哉，堀邦夫，西川和孝，
申请(专利权)人：奥林巴斯株式会社，
类型：
国别省市：
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