本发明专利技术涉及一种电化学生物传感器制备方法，尤其涉及一种脱氢酶型电化学生物传感器的制备方法。本发明专利技术通过将传感器制备过程中的电极修饰所需要的全部组分(包括碳纳米材料、电子介体、高分子聚合物、脱氢酶、辅酶和缓冲液)制备成为一种纳米生物复合材料，并将该复合材料通过简单的一步滴涂法修饰到丝网印刷电极表面，制备脱氢酶型电化学生物传感器。本方法简化了脱氢酶型传感器的制备工艺，适用于批量生产，减小了批内、批间差异，提高了检测的灵敏度、准确性和存储稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种电化学生物传感器的制备方法，尤其涉及脱氢酶型生物传感器的制备方法。
技术介绍
随着社会发展的日新月异和人们生活水平的显著提高，传统的临床检验模式，由于存在标本从采集到检测前缺乏有效的分析前质量控制，标本检测周期较长，对仪器的依赖程度较高等不足，已然不能满足人们越来越高涨的健康评估需求。随着科技的突飞猛进，POCT (Point of Care Test)产业焕发出了新生的活力。由于具有检测快速、操作简单易学、检测成本低廉的突出优点，POCT在临床检验效能中所占的比重越来越大。近年来，POCT领域中的一个重要分支，电化学生物传感器，作为一种现场定量检测标本的新技术，能够有效地弥补干化学试纸条和金标条只能定性、不能定量的不足，因而受到了国内外科技工作者的广泛关注。电化学生物传感器的基本原理是将生物识别层修饰到工作电极的表面，通过生物识别层与样本中的底物发生特异性氧化还原反应，从而产生可检测的电化学信号，直接或间接反映待测底物的浓度。脱氢酶系统是生物体内重要的新陈代谢系统，约有300种脱氢酶参与生命的运作。通过脱氢酶与特异的底物发生氧化还原反应，我们可以定量评估该特异的底物在体内的分布和代谢情况，进而直观地了解生命健康状况。反应模型以如下方程式表示 底物 +NAD+/NADP+ 廳_ r 产物 +NADH/NADPH + H+比如，基于葡萄糖脱氢酶检测血糖含量，用于诊断糖尿病及评估治疗效果；又如，基于乳酸脱氢酶检测血乳酸含量，用于评估患者缺氧情况，便于医师采取有效地治疗措施。在脱氢酶系统中，氧化还原反应需要氧化型辅酶NAD+或NADP+的参与，生成还原型辅酶NADH或NADPH。研究发现，还原型辅酶NADH或NADPH是电活性物质，在一定的激发电压下，可氧化产生电流，此现象为脱氢酶型电化学生物传感器的研发奠定了理论基础。然而，电化学生物传感器检测NADH或NADPH，面临着一些难点(I)在电极表面直接氧化NADH或NADPH的过电位较高，导致电极容易因吸附反应产物而钝化和受到其他电活性物质(比如，抗坏血酸、尿酸、儿茶酚胺、多巴胺以及一些药物分子)的干扰，检测结果的准确性难以保证；(2)制备的传感器检测NADH或NADPH的灵敏度不高，导致传感器对目标物的检测敏感度不够，难以识别低浓度的目标分子；(3)目前，文献中报道的关于脱氢酶型传感器的制备方法往往包括多步修饰(Talanta. 2012,99 =697-702 ；Sensors. 2010，10 748-764 Analytical Biochemistry. 2012,425 :36-42)，或者是辅酶未预先修饰到电极表面(Electroanalysis· 2010, 22 :1707-1716 ;Biosensors and Bioelectronics. 2012,33 100-105)，而是作为试剂与待测标本混合后才用于检测。虽然这些方法能够一定程度上提高传感器的性能，但也导致所制备的生物传感器未能充分体现检测快速，操作简单、现场检测的优点。碳纳米材料，具有独特的电化学性质和物理性质，比如，高效的电催化活性、高比表面积、宏观量子隧道效应和优良的生物相容性，在电化学传感器领域具有广泛的应用价值。碳纳米材料作为传感器的电极修饰材料，能够明显地提高传感器检测的灵敏度和线性范围，并且极大地降低还原型辅酶NADH或者NADPH在电极表面氧化的过电位，有效地避免了一些电活性物质，比如尿酸、儿茶酚胺、多巴胺的干扰。但是，抗坏血酸的干扰却未能有效消除，使得传感器的准确性和实用性仍然面临巨大挑战(Electroanalysis. 2011,23 :842-849)。研究发现，一些电子介体，如麦尔多拉蓝、亚甲蓝、亚甲绿等，能特异的与NADH或者NADPH形成复合物，进而实现低电位检测NADH或者NADPH，而不受其他电活性物质的干扰。然而，这些电子介体为水溶性分子，常规包埋的方法不能有效地使其固定在电极的表面而不发生丢失，导致电化学信号很不稳定。文献已经报道通过电聚合的方法能高效地固定电子介体(Talanta. 2000, 51 :187-195 ;Journal of Solid StateElectrochemistry. 2008,12 :175-180),但电聚合的方法增加电子介体消耗，增加传感器的制备步骤，增大传感器的批内、批间差异。此外，利用碳纳米材料或阴离子型聚合物直接吸附电子介体也有文献报道。例如，Zhu等将N，N-二甲基甲酰胺分散的羧基化碳纳米管修饰到玻碳电极表面，然后将其浸入麦尔多拉蓝溶液中，吸附一段时间，得到了碳纳米管/麦尔多拉蓝修饰电极，该传感器对还原型辅酶NADH表现出高的灵敏度和宽的线性范围(Biosensors and Bioelectronics. 2007,22 :2768-2773) ;zheng 等将碳纳米管 / 纳米金/Nafion-117复合膜修饰的丝网印刷电极浸入麦尔多拉蓝溶液中一段时间，得到了碳纳米管/纳米金/麦尔多拉蓝/Nafion-117复合膜修饰电极，并用该复合膜电极成功制备乙醇脱氢酶型传感器，得到的电极表现出优良的稳定性和准确性(ForensicScienceInternational. 2011,207 :177-182)，但这两种方法同样表现出电极修饰步骤较多，无法对传感器进行快速批量生产的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可用于批量生产脱氢酶型电化学生物传感器的快速制备方法。本专利技术是通过以下技术方案来实现的(I)将碳纳米材料超声分散于高分子聚合物中，得到均匀分散的碳纳米材料悬液后，加入电子介体，混匀后过夜，再加入脱氢酶、辅酶和缓冲液，再次混匀，即得到修饰电极所需的纳米生物复合材料；(2)将制备的纳米生物复合材料滴涂到丝网印刷电极的工作电极表面，4摄氏度避光晾干，即得脱氢酶型电化学生物传感器。所述碳纳米材料包括单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、有序介孔碳或石墨烯中的一种或几种。所述电子介体包括麦尔多拉蓝、亚甲蓝、新亚甲蓝或亚甲绿中的一种或几种。所述高分子聚合物为壳聚糖。所述脱氢酶包括葡萄糖脱氢酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、a-羟丁酸脱氢酶或异柠檬酸脱氢酶中的一种。所述辅酶包括氧化型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADP+)的一种或两种。所述纳米生物复合材料的pH值为6. O 6. 5。所述缓冲液包括醋酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中的一种或几种。所述丝网印刷电极为2电极体系或3电极体系中的一种。本专利技术中，制备纳米生物复合材料所使用的材料均行使着不同的作用和功 能高分子聚合物作为碳纳米材料的分散剂和脱氢酶的固定剂；碳纳米材料作为信号放大材料和电子介体的固定载体；电子介体作为还原型辅酶NADH的高效识别分子来实现低电位检测；缓冲液作为稳定剂来稳定酶、辅酶和电子介体的活性。本专利技术通过科学、合理地制备纳米生物复合材料，用于一步滴涂的方法构建脱氢酶型电化学生物传感器，从而简化脱氢酶型生物传感器的制备工艺，提高存储稳定性和检测准确性。具体实施例方式下面结合实施例对本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脱氢酶型电化学生物传感器制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将碳纳米材料超声分散于高分子聚合物中，得到均匀分散的碳纳米材料悬液后，加入电子介体，混匀后过夜，再加入脱氢酶、辅酶和缓冲液，再次混匀，即得到修饰电极所需的纳米生物复合材料；(2)将制备的纳米生物复合材料滴涂到丝网印刷电极的工作电极表面，4摄氏度避光晾干，即得脱氢酶型电化学生物传感器。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：花尔辉，谢国明，蒋舒婷，赵朝辉，马翠霞，王力，景小莹，罗鹏，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：
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