本发明专利技术公开了一种可寻址电化学传感器阵列制备，及采用所述的可寻址电化学传感器测定样品中多种肿瘤标志物的方法。通过配制合适的油墨，在适当的基底材料上，印刷行电极和列电极；选择合适的纸材料，利用蜡打印技术在纸上制备反应疏水区域和亲水区域，在另一层纸基材料上通过丝网印刷技术构建阵列电极共用的参比电极和对电极；对制备好的亲水区域功能化，抗原识别，信号分子标记；将制备好的工作电极、参比电极及对电极和制备好的反应区域进行组装，构建可寻址电化学传感器阵列；在反应区域滴加酶底物，在印有参比电极及对电极的纸层上加入磷酸缓冲溶液，对目标物进行检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤标志物检测
，更具体地说是一种可寻址电化学传感器阵列制备，本专利技术还涉及采用所述的可寻址电化学传感器测定样品中多种肿瘤标志物的方法。
技术介绍
癌症是严重威胁人类健康的具有高发病率和高死亡率的疾病之一，然而，若在癌症发展的早期阶段即能将其诊断出来，将大大提高病人的存活率。可以说，早期诊断和早期治疗是预防癌症发展和降低死亡率最有效的办法之一。肿瘤标志物是在肿瘤发生和增殖过程中由肿瘤细胞所产生、分泌并释放到血液、细胞、体液中，反映肿瘤存在和生长的一类物质。它是肿瘤细胞在人体内存状态的具体表征，可以直接反应肿瘤细胞在体内的发展以及患者治疗效果等情况。目前已有少量肿瘤标志物被应用于临床检测。然而，单个肿瘤标志物的检测往往导致肿瘤检测的假阳性或假阴性，如果能同时检测多种肿瘤标志物则可以大大提高肿瘤检测的灵敏性、特异性和准确性。建立一种高灵敏度和特异性的快速筛检多种肿瘤标志物的方法，便成为当前该研究领域亟需解决的问题之一。目前已有的肿瘤标志物检测或筛检方法存在不足临床上为了避免单一肿瘤标志物在检测中的阳性率不高、特异性不强等问题，常采用多种肿瘤标志物联合检测，应用多变量分析的方法来提高肿瘤诊断的阳性率和特异性。常用的血清肿瘤标志物检测方法有放射免疫分析、酶联免疫分析以及化学发光免疫测定等，这些方法都有一个共同的局限性，即每次仅能检测一种肿瘤标志物。对于多种肿瘤标志物检测一般采用多信号标记模式，该模式需要同时检测不同标记的信号，因此通常存在一定的困难在准确定量，由于信号交叉及不同标记的最优条件差异，同时非常困难找到多种标志物的可利用的标记信号分子。为了克服这些缺点，设计采用空间分辨模式，不同目标物在不同的反应区域进行检测。电化学免疫传感器是一种将电化学分析方法与免疫学技术相结合而发展起来的具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点的生物传感器。与传统的免疫测试相比，免疫生物传感器集免疫反应、信号产生、信号检测一体化，具有定量检测和实时检测传感器表面的抗原抗体反应的功能，有利于对免疫反应进行动力学分析，尤其在临床肿瘤标志物诊断领域，其作用越来越受到重视，成为目前较活跃的研究领域。采用空间分辨模式，不同目标物在不同的反应区域进行检测，设计可寻址电化学免疫传感器能够实现多种肿瘤标志物同时检测、快速、成本低、微型化、高通量、现场检测。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供了一种可寻址电化学免疫传感器阵列的制备及能够实现多种肿瘤标志物同时、快速、成本低、微型化、高通量、现场检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术是通过以下措施来实现的一种可寻址电化学免疫传感器阵列的制备方法，其特征是包括以下步骤 (1)配制合适的油墨，选择合适的基底材料，印刷行电极(rowelectrode)和列电极(column electrode)； (2)选择合适的纸基材料，利用蜡打印技术在纸上制备反应疏水区域(绝缘区域)和亲水区域(反应区域)； (3)在另一层纸基材料上通过丝网印刷技术构建阵列电极共用的参比电极和对电极； (4)对(2)中未水区域功能化，将包被抗体和硫堇固定在未水区域； (5)将目标物或者血清样品在固定包被抗体的反应区域孵育； (6)酶和信号抗体固定于多壁碳纳米管制备信号放大分子； (7)将(6)制备好的信号放大分子加入到(5)处理过的区域孵育一定时间； (8)将(I)制备好的工作电极及(3)制备好的参比电极及对电极和制备好的反应区域进行组装，构建可寻址电化学传感器阵列； (9)在反应区域滴加酶底物，在印有参比电极及对电极的纸层上加入磷酸缓冲溶液(PBS )，连接电化学设备进行检测。一种制备上述可寻址电化学传感器阵列的方法，及对血液中的肿瘤标志物进行检测，其特征在于该方法的具体步骤为 (1)采用丝网印刷技术、石墨为原料，取等体积的丙酮和环己酮溶液，再加入对应量的乙酸纤维素，使用超声波超声使乙酸纤维素充分地溶解在丙酮和环己酮的混合溶剂中，最后加入一定量的石墨粉，用玻璃棒充分混匀，在聚乙烯对苯二甲酸酯基底上印制直径5mm的行电极和列电极，正交后行电极与列电极重合，形成4X6电极阵列； (2)用Adobeillustrator CS4设计图案，利用蜡打印技术在纸上打印图案，将打印蜡的图案放在恒温150°C下2min，未打印蜡的地方亲水区作为工作区； (3)通过丝网印刷技术在另一张纸上印刷碳对电极和Ag/AgCl参比电极； (4)将多壁碳纳米管(MWCNTs)在3:1H2S04/HN03溶液中、功率300W下超声5h进行羧基化，在(2)制作的工作区中加入一定量的羧基化的MWCNTs，滴加一定量的0.25 mg/mL壳聚糖，室温干燥，滴加2. 5%的戊二醛活化2h，将包被抗体和硫堇固定到工作区，加入2%牛血清白蛋白封闭活性位点，制备修饰工作区； (5)将目标抗原或者血清样品加入到(4)制备的工作区，孵育一定时间； (6)利用步骤(4)中羧基化的多壁碳纳米管，将辣根过氧化物酶和信号抗体按照一定比例在碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)的活化下将辣根过氧化物酶和信号抗体固定于 MWCNTs 上； (7)将(6)制备好的负载信号抗体和辣根过氧化物酶的多壁碳纳米管加入到制备好的(5)中，孵育一定时间； (8)将(I)制备好的工作电极及(3)制备好的参比电极及对电极和制备好的反应区域进行构建电极阵列，连接相应电化学设备对肿瘤标志物的进行检测； (9)在工作区域加入辣根过氧化物酶底物0.lmol/L H2O2，将对电极和参比电极纸层在0. lmol/L的磷酸缓冲溶液(PBS)中浸湿，检测电流信号。本专利技术所述电极基底材料为聚乙烯对苯二甲酸酯、聚氯乙烯、陶瓷或者玻璃。本专利技术所述纸材料为I级色谱纸、3级色谱纸、4级色谱纸和17级色谱纸。本专利技术构建了一种新型可寻址电化学传感器阵列，用于检测多种肿瘤标志物及癌症的筛查，取得了满意的结果，应用前景广泛。附图说明图1 : A. a为行电极，b为Ag/AgCl为反应参比电极,c为工作区，d为列电极；B.可寻址电化学传感器阵列检测体系。图2 :工作区的组装原理图。具体实施例方式 可寻址电化学传感器阵列的制备及用于多种肿瘤标志物的检测和癌症的筛查 (1)采用丝网印刷技术、石墨为原料，首先取等体积的丙酮和环己酮溶液混合称重，再称取对应量的乙酸纤维素加入上述溶液中，使用超声波超声使乙酸纤维素充分地溶解在丙酮和环己酮的混合溶剂中，最后加入一定量的石墨粉,用玻璃棒充分混勻,在聚乙烯对苯二甲酸酯基底上印制直径5mm的行电极和列电极，正交后行电极与列电极重合，形成4X6电极阵列； (2)用Adobeillustrator CS4设计图案,利用腊打印技术通过打印机在I级色谱纸上打印图案，将打印蜡的图案放在恒温150°C下2min，在设计的纸上图案区作为疏水区，未打印蜡的地方亲水区作为工作区，每张纸上印有24工作区(4X6，直径5mm)； (3)通过丝网印刷技术在另一张纸上印刷碳对电极和Ag/AgCl参比电极； (4)将多壁碳纳米管(MWCNTs)在3:1H2S04/HN03溶液中、功率300W下超声5h进行羧基化，在(2)制作的工作区中加入10 UL的功能本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可寻址电化学传感器阵列的制备及能够实现多种肿瘤标志物同时检测，其特征是包括以下步骤：1.1配制合适的油墨，在适当的材料上，制备行电极和列电极；1.2选择合适的纸材料，在纸上制备反应疏水区域和亲水区域；1.3构建所有反应区域共用的参比电极和对电极；1.4对1.2中亲水区域功能化，将包被抗体和硫堇固定在亲水区域；1.5将目标物和血清样品在固定包被抗体的反应区域孵育；1.6酶和信号抗体固定于多壁碳纳米管制备信号放大分子；1.7将1.6制备的信号放大分子加入到1.5中孵育一定时间；1.8将1.1制备好的工作电极及1.3制备好的参比电极及对电极和制备好的反应区域进行组装，构建可寻址电化学传感器阵列；1.9在反应区域滴加酶底物，在印有参比电极及对电极的纸层上加入磷酸缓冲溶液（PBS），检测电流信号。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：葛慎光，于京华，颜梅，葛磊，黄加栋，张彦，李伟平，李蒙，王衍虎，李龙，苏敏，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：
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