本发明专利技术公开了一种枇杷细胞悬浮培养液及悬浮培养方法。其中，培养液包括：MS基本培养基，2,4-D0.5-6.0mg/L；NAA0.5-6.0mg/L；IBA0.5-6.0mg/L；KT?0-4.0mg/L；BA0-4.0mg/L；蔗糖1-3.5%；pH4.0-6.5。培养方法为愈伤组织在该培养液中培养。本发明专利技术建立了枇杷细胞液体培养体系，采用本发明专利技术最佳方式培养，枇杷细胞培养物中熊果酸的得率为36.49mg/g·DW。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地涉及枇杷细胞悬浮培养方法。
技术介绍
熊果酸是枇杷叶中最重要的次生代谢物质，被中国医药科学院肿瘤医院实验证明有望成为低毒、有效的新型天然抗癌药物，市场十分紧缺。目前产品多从枇杷叶片进行有机提取，成本高。提取方法可见 CN200710008809. 9,200910154645. X,201210057030. 7 等。现有技术中主要集中在对枇杷的愈伤组织培养和无性快繁体系的建立；对枇杷叶活性成份的提取及其药理研究。植物细胞悬浮培养途径生产次生代谢产物是目前中药生产中的重要技术路线，但目前在枇杷研究中，尚无建立悬浮培养体系以提取熊果酸等三萜类化合物的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种枇杷细胞悬浮培养方法，来生产天然熊果酸，以解决现有技术中存在的上述问题。—种枇杷细胞悬浮培养方法，细胞悬浮培养基配方为MS基本培养基+0. 5mg/LNAA+3%蔗糖，pH值为6. O ;外界调控条件为光照条件为400Lux (12h/d)，采用250ml的三角瓶装液100ml，接种量为40-60g/L · FW，摇床转速为130r/min，采用透气膜封口，培养18天收获。由于传统的枇杷叶熊果酸提取方法存在多种局限性，本专利技术提供了用于枇杷细胞悬浮培养的培养液以及培养方法。本专利技术以枇杷幼胚为材料，进行优良愈伤组织的诱导，优良愈伤组织经过多次继代培养转入液体培养基，继而进行悬浮培养条件的筛选同时检测目标产物熊果酸的含量，从而建立了枇杷愈伤组织悬浮培养体系，为通过枇杷细胞悬浮培养提取熊果酸的产业化生产奠定基础。其中，采 用最佳方式培养，枇杷细胞培养物中熊果酸的得率为36. 49mg/g *DW。比目前洪燕萍文献报道中枇杷叶(南亚枇杷)中最高熊果酸的含量(14. 01mg/g · Dff)提高了约 160. 46%。附图说明图1为本专利技术实施例中枇杷细胞悬浮培养生长曲线及熊果酸含量图。具体实施例方式试验材料枇杷幼果，采自福建省莆田市果树研究所。枇杷细胞有效成分熊果酸的提取方法为现有技术超声波萃取法，具体为溶剂为95%乙醇，料液比1:30 (g/ml)，超声波萃取，萃取温度40°C，萃取频率为25KHZ，萃取功率260W，提取次数I次，超声时间40min。用液相色谱(HPLC)测定。实施例1枇杷愈伤组织的获得采用现有技术，从枇杷幼果诱导获得，诱导培养基为MS基本培养基+Img/L2, 4-D+O. 5mg/L KT+蔗糖2%+6. 8g/L琼脂粉，PH 5. 8，25°C，黑暗培养，同一培养基及培养条件继代培养5次后，转入悬浮培养。枇杷细胞悬浮培养体系的建立及培养方法材料选取固体培养基上淡黄色、生长状态良好、质地疏松、枇杷幼胚诱导而来的胚性愈伤组织。以原有固体培养基配方及培养条件(实施例1中，诱导培养基为MS基本培养基 +lmg/L 2，4-D+O. 5mg/L KT+蔗糖 2%, PH 5. 8，25°C，黑暗培养，摇床转速 110r/min)连续继代5代以上，获得均一的悬浮液，以进行后续的调控研究(实施例2-9)。调控研究中所采用的培养液配方及培养条件为MS基本培养基+lmg/L 2, 4-D+O. 5mg/L KT+蔗糖2%，PH5.8，25°C，黑暗培养，摇床转速110r/min，考察某个因素时，固定其它因素来研究。主要考察指标悬浮培养物鲜重比生长速率、熊果酸含量。收获时的培养物重量一接神时的培养樹.重量悬浮培养物鲜重比生长速率=.接种时的培养物.重量X 100%熊果酸以超声波萃取，含量用液相色谱(HPLC)测定实施例2激素对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响表12，4D对悬浮培养细胞生长和熊果酸含量的影响权利要求1.一种用于枇杷细胞悬浮培养的培养液，包括 MS基本培养基；2,4—D 0. 5-6. Omg/L ； NAA 0.5-6. Omg/L ；IBA 0.5-6. Omg/L ；6-BA 0-4. Omg/L ； KT 0-4. Omg/L ； 鹿糖 1-3. 5% ； pH 4. 0-6. 5。2.—种用于枇杷细胞悬浮培养的培养液，其特征在于，MS基本培养基+0. 5mg/LNAA+3% 蔗糖+PH 6. O03.—种枇杷细胞悬浮培养方法，包括如下步骤 (1)培养获取枇杷愈伤组织； (2)提供权利要求1或2的枇杷细胞悬浮培养液； (3)愈伤组织在悬浮培养液中进行悬浮培养； (4)收获细胞，提取熊果酸。4.一种枇杷细胞悬浮培养方法，细胞悬浮培养基配方为MS基本培养基+0. 5mg/LNAA+3%蔗糖，pH值为6. 0 ;外界调控条件为光照条件为400LuX，12h/d，采用250ml的三角瓶装液100ml，接种量为40-60g/L FW，摇床转速为130r/min，采用透气膜封口，培养18天收获。全文摘要本专利技术公开了。其中，培养液包括MS基本培养基，2,4-D0.5-6.0mg/L；NAA0.5-6.0mg/L；IBA0.5-6.0mg/L；KT 0-4.0mg/L；BA0-4.0mg/L；蔗糖1-3.5%；pH4.0-6.5。培养方法为愈伤组织在该培养液中培养。本专利技术建立了枇杷细胞液体培养体系，采用本专利技术最佳方式培养，枇杷细胞培养物中熊果酸的得率为36.49mg/g·DW。文档编号C12N5/02GK102994443SQ20121045773公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日专利技术者李惠华, 刘小英, 苏明华, 王伟, 常强, 陈淳, 徐剑 申请人:福建省亚热带植物研究所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于枇杷细胞悬浮培养的培养液，包括：MS基本培养基；2,4?D??0.5?6.0mg/L；NAA????0.5?6.0mg/L；IBA????0.5?6.0mg/L；6?BA???0?4.0mg/L；KT?????0?4.0mg/L；蔗糖???1?3.5%；pH?????4.0?6.5。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李惠华，刘小英，苏明华，王伟，常强，陈淳，徐剑，
申请(专利权)人：福建省亚热带植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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