针对在植物中赋予对2,4-二氯苯氧乙酸的抗性的酶的单克隆抗体检测方法技术

本文中描述了可用于测定和定量酶芳氧基链烷酸酯双加氧酶的存在的单克隆抗体和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,4-二氯苯氧乙酸的抗性的酶的单克隆抗体检测方法, 4- 二氯苯氧乙酸的抗性的酶的单克隆抗体检测方法对相关申请的交叉引用本申请要求2010年6月4日提交的美国临时专利申请61/351，593的权益，其公开内容在此通过提述完整并入。
技术介绍
2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)属于苯氧酸类的除草剂，并且已经在许多单子叶植物作物诸如玉米、小麦、和稻中用于选择性控制阔叶杂草，而对期望的作物植物没有严重损害。2，4-D是一种合成生长素衍生物，其作用为使正常的细胞-激素体内稳态脱调节并 阻碍平衡的、受控的生长；然而，这类除草剂的确切作用模式仍未得到完全了解。定草酯(triclopyr)和氟草烟(fluroxypyr)是卩比唳基氧乙酸除草剂,它们也充当合成生长素。这些除草剂对某些植物具有不同的选择性水平(例如双子叶植物比单子叶植物更敏感)。不同植物的差异代谢是对选择性水平变化的一种解释。一般地，植物缓慢代谢2，4-D，因此对2，4-D的植物响应变化可能更有可能通过靶位置处的不同活性解释(WSSA, 2002;Herbicide Handbook 第 8 版；Weed Science Society ofAmerica;Lawrence, KS第492页)。2，4-D的植物代谢通常经由两阶段机制(通常是轻基化，接着是与氨基酸或葡萄糖缀合)发生(WSSA，2002)。随着时间推移，用2，4-D攻击的某些微生物群已经形成一种用于降解此异生素的替代途径，这导致2，4-D的完全矿化。除草剂的连续应用选择出能利用该除草剂作为碳源和能源进行生长的微生物，给予它们在土壤中的竞争优势。出于此原因，目前配制的2，4-D具有相对较短的土壤半衰期，并且对后续的作物没有显著的遗留影响。—种已经对其降解2，4-D的能力进行过广泛研究的生物体是真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha) (Streber 等；1987;Analysis, cloning, and high-levelexpression of 2, 4-dichlorophenixyacetic monooxygenase gene tfdA of Alcaligeneseutrophus JMP134. J. Bacteriol. 169:2950-2955)。编码矿化途径起始步骤中的酶的基因是tfdA。参见美国专利No. 6，153,401和GENBANK登录号M16730。TfdA基因产物经由α -酮戊二酸依赖性双加氧酶反应催化2，4-D到二氯苯酚(DCP)的转化(Smejkal等；2001.Substrate specificity of chlorophenoxyalkanoic acid-degrading bacteriais not dependent upon phylogeneticalIy related tfdA gene types. Biol. Fertil.Sols 33:507-513)。DCP相比于2，4_D具有很少的除草剂活性。已经在转基因植物中使用TfdA来在对2，4-D天然敏感的双子叶植物诸如棉和烟草中赋予2，4-D抗性(Streber等；1989.Transgenic tobacco plants expressing a bacterial detoxifying enzyme areresistant to 2, 4-D. Bio/Technology7:811-816 和美国专利 No. 5, 608, 147)。已经从土壤细菌中分离出编码能够降解2，4-D的酶的大量tfdA型基因，并且将其序列存储于Genbank数据库中。许多tfdA同源物(大于85%氨基酸同一'丨生)与tfdA具有类似的酶特性。然而，存在许多如下的同源物，其与tfdA具有显著较低的同一性(25-50%)，但具有与α-酮戊二酸双加氧酶Fe+2双加氧酶有关的特征性残基。因此，这些趋异的双加氧酶的底物特异性是什么并不明显。一个与tfdA具有低同源性(31%氨基酸同一性)的独特例子是来自食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)的 sdpA(Kohler, H. P. E. 1999;Delftia acidovoransMH:a versatile phenoxyalkanoic acid herbicide degrader;J. Ind Microbiol andBiotech. 23: 336-340. Westendorf 等；2002. The two enantiospecif ic dichlorprop/a -ketoglutarate-dioxygenases from Delftia acidovorans MCl—protein andsequence data of Rdpa and SdpA. Microbiol. Res. 157:317-22.)。已经显不了此酶催化⑶-滴丙酸(dichlorprop)(和其它(S)-苯氧丙酸)以及2，4-D (一种苯氧乙酸)矿化中的第一步(Westendorfet 等；2003. Purification and characterizationof the enantiospecific dioxygenases from Delftia acidovorans MCI initiatingthe degradation of phenoxypropionates and phenoxyacetate herbicides.ActaBiotechnol. 23:3-17)。 经植物密码子优化的芳氧基链烷酸酯双加氧酶基因AAD-12(其编码最初从食酸代尔夫特菌分离的酶)在W02007/053482(其通过提述并入本文)中在作为除草剂抗性性状使用方面第一次描述。该性状赋予对2，4-D及对吡啶基氧乙酸除草剂的耐受性。携带AAD-12基因的经转化大豆第一次报告于美国临时专利申请No. 61/263950，其通过提述并入本文。为种植种子产品开发并销售重组DNA性状的公司制定、执行并遵守严格的产品管理计划。这些管理计划需要对重组性状使用证实的定量和定性蛋白质检测方法来追踪性状基因渗入(intoogression)和种子生产活动，以及对谷粒收获监测该性状。这些检测方法必须是容易且强力的，使得足以在GLP和非GLP条件下使用。此外，方法必须是对用户友好的，使得足以田间的农民、粮仓的粮商和边境的海关行政人员容易地采用。因此，强力的、高质量、用户友好的蛋白质检测方法和商业试剂盒是有用且必需的。尽管免疫测定法是本领域公知的，开发可再现地能够在实验室和田间背景两者中检测一批植物组织中特定转基因产物的强力的、高质量、证实的ELISA(酶联免疫吸附测定法)方法既不是不重要的，也不是常规的。更具挑战的是，寻找特别适用于开发用于检测AAD-12转基因事件的侧向流动条ELISA的抗体对。专利技术概述本专利技术提供了一组单克隆抗体(单抗)和生成它们的杂交瘤细胞系。所述系按照布达佩斯条约的条款保藏于美国典型培养物保藏中心。令人惊讶地，这些单抗完全适用于在多种植物和植物组织中检测AAD-12转基因事件基因产物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：单国民，林高峰，JK史密斯德雷克，MJ索萨，
申请(专利权)人：陶氏益农公司，
类型：
国别省市：