一种基因工程包涵体的洗涤方法技术

本发明专利技术公开了一种基因工程包涵体的洗涤方法，该方法采用中空纤维膜处理基因工程包涵体的洗涤，可实现连续自动操作，工艺过程简单，操作方便，提高了生产效率，得到的包涵体收率高、纯度高、特别适合于大规模工业化生产上的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，具体涉及，特别涉及了一种利用中空纤维滤膜对基因工程包涵体进行洗涤的方法。
技术介绍
基因重组技 术可以用来大量生产自然界极其微量的功能蛋白或多肽，大肠杆菌等原核生物因其生长速度快，营养要求低，通常作为基因重组技术的首选宿主菌。然而，用大肠杆菌高效表达的重组蛋白常常会形成不溶性的且无活性的包涵体。包涵体是重组基因在表达过程中因蛋白质的二级结构错误折叠所形成的一种致密性的结构，这种结构有利于重组蛋白不被胞内蛋白酶水解，保证了重组蛋白的高效表达。基因工程包涵体可以通过变性剂将其溶解，再缓慢除去变性剂，从而使其恢复天然活性。由于基因包涵体不仅仅含有重组蛋白，还有外膜蛋白，质粒DNA和其他杂质，因此为了提高包涵体的质量，增加其中重组蛋白的含量，以利于重组蛋白重新折叠恢复其天然构象，通常需要将包涵体经过充分洗涤，以除去细胞膜等脂溶性组分，杂蛋白，核酸等物质， 提高包涵体的纯度。包涵体洗涤的传统方法为第一次洗涤加入含一定比例去垢剂(曲拉通、吐温等)的缓冲液，将包涵体悬液搅拌洗涤一定时间后离心去除上清，收集沉淀；第二次洗涤加入含低浓度变性剂(2-4M脲、1-2M盐酸胍)的缓冲液，将包涵体悬液搅拌洗涤一定时间后离心去除上清，收集沉淀；根据需要再洗涤第三次或第四次，同样离心去除上清，收集沉淀。李晓红等在《重组人胰岛素制备工艺》(《四川大学学报》，2007年)中报道了重组人胰岛素原包涵体的收集和洗涤，包涵体先用含2 M尿素的缓冲液洗涤第一次，4度17000g 离心收集沉淀；沉淀再用含2%脱氧胆酸钠的缓冲液洗涤第二次，4度17000g离心收集沉淀；沉淀再用Tris缓冲液洗洚两次，同样4度17000g离心收集沉淀。但对洗漆得到的包涵体的纯度和收率没有详细的数据报道。许崇利等在《重组人Y-干扰素纯化工艺的建立》 (《中国兽药杂志》，2012年)中报道了 Y-干扰素包涵体的纯化，加入洗涤液洗涤四次，以 10000r/m离心收集包涵体，电泳检测其纯度达90%。传统洗涤方法需要使用高速离心机或者连续流离心机来完成，由此带来一系列的问题如成本高昂、操作繁琐、容易产生污染、维修成本高、工艺放大困难。虽然获得的包涵体纯度较高，但包涵体的收率较低。中空纤维过滤膜以其独特的开放式流路结构，温和低剪切力，可以很好地满足对剪切力敏感的生物大分子以及成分较复杂的生物样品不同规模的浓缩和过滤需要，广泛用于单抗、病毒类疫苗、菌苗、多糖、核酸、中草药、生化药以及乳品饮料等各个领域。中空纤维膜开放式的流路，可以直接处理菌体发酵液或高密度细胞培养液等含有固体的复杂料液而不会堵塞流路，省去离心等繁琐的前处理步骤。然而，目前还没有将中空纤维滤膜用于包涵体洗涤的文献报道。
技术实现思路
为了解决现在基因工程包涵体洗涤工艺中存在的问题，达到减少复杂操作，易于工业化生产的目的，本专利技术人经过大量创造性试验研究，提供一种利用中空纤维滤膜进行基因工程包涵体洗涤的方法。本专利技术的目的是这样实现的，包括如下步骤a、膜平衡取中空纤维膜，用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为 (trans-membrane pressure、TMP) 5 15 bar,透过通量(Flux,单位升 / 平米 / 小时，L/ m2 /hr、LMH)为 10 30 LMH ；b、第一次洗涤配制洗涤缓冲液I，按5 15 :1 (V/W)加入包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力(trans-membrane pressure、TMP)为 5 15 bar，透过通量(Flux，单位升/平米/小时，L/m2/hr、LMH)为10 30 LMH，包涵体悬液被浓缩3 5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液I的组成为20 100 mM Tris-HCl，I 5% 曲拉通-Χ_100，ρΗ9· 0，或者组成为 20 100 mM Tris-HCl，I 5% 吐温-20，ρΗ9· O ；C、第二次洗涤配制洗涤缓冲液II，按5 15:1 (V/W)加入步骤b处理后的包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力 (trans-membrane pressure>TMP)为 5 15 bar,透过通量(Flux,单位升 / 平米 / 小时， L/ m2 /hr、LMH)为10 30 LMH，包涵体悬液被浓缩3 5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液II的组成为20 100 mM Tris_HCl，2 4 M尿素，pH9. 0，或者组成为 20 100 mM Tris-HCl，I 3 M 盐酸胍，ρΗ9· O ；d、第三次洗涤配制洗涤缓冲液III，按5 15:1 (V/W)加入步骤c处理后的包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力为 (trans-membrane pressure、TMP) 5 15 bar,透过通量(Flux,单位升 / 平米 / 小时，L/ m2 /hr,LMH)为10 30 LMH，包涵体悬液被浓缩3 5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液； 所述洗涤缓冲液III的组成为20 100 mM Tris-HCl, pH9. O。中空纤维滤膜的材质会显著影响滤膜的化学耐受性、过滤速度、吸附性能，因此本专利技术对用于基因工程包涵体洗涤所用的中空纤维滤膜进行了优选。优选地，所述基因工程包涵体的洗涤方法，其中所述中空纤维膜的材质为聚醚砜(PES)，或是再生纤维素(RC)，或是醋酸纤维素(CA)，或是亲水性聚偏氟乙烯(PVDF)。中空纤维滤膜同时具有多种纤维管内径可选，应用于不同性质的料液，因此本专利技术对用于基因工程包涵体洗涤的中空纤维滤膜的纤维管内径进行了优选。优选地，所述基因工程包涵体的洗涤方法，其中所述中空纤维膜的纤维管内径为O. 75-1. 75mm。另外，本专利技术对用于基因工程包涵体洗涤的中空纤维滤膜的滤膜孔径进行了优选。优选地，所述基因工程包涵体的洗涤方法，其中所述中空纤维膜的滤膜孔径为750 k、 O. I μπι、0. 2 μ m 或 O. 45 μ m。本专利技术与现有技术相比具有如下优点和显著的进步中空纤维膜开放式的流路，可以直接处理菌体发酵液或高密度细胞培养液等含有固体的复杂料液而不会堵塞流路，省去离心等繁琐的前处理步骤。本专利技术利用中空纤维膜处理基因工程包涵体的洗涤，可实现连续自动操作，工艺过程简单，操作方便，提高了生产效率，得到的包涵体纯度高、收率高、特别适合于大规模工业化生产上的应用。具体实施方式现通过以下实施例来进一步描述本专利技术的有益效果，实施例仅用于例证的目的， 不限制本专利技术的范围，同时本领域普通技术人员根据本专利技术所做的显而易见的改变和修饰也包含在本专利技术范围之内。实施例I大肠杆菌表达重组人胰岛素原包涵体(O. 2公斤)的洗涤中空纤维膜(聚醚砜材质，纤维管内径为I mm，滤膜孔径为O. I ym)先用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为15 bar，透过通量为30 LMH。将3 L洗涤缓冲液I (20 mM Tris-HCl, 1%曲拉通-Χ_100，pH9. O)加入O. 2公斤大肠杆菌表达重组人胰岛素原包涵体，搅拌使成悬浮液，将包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因工程包涵体的洗涤方法，其特征在于包括如下步骤：a、膜平衡：取中空纤维膜，用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为5～15?bar，透过通量为10～30?LMH；b、第一次洗涤：配制洗涤缓冲液Ⅰ，按5～15：1（V/W）加入包涵体，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力为5～15?bar，透过通量为10～30?LMH，包涵体悬液被浓缩3～5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液Ⅰ的组成为20～100?mM?Tris?HCl，1～5%?曲拉通?X?100，pH9.0，或者组成为20～100?mM?Tris?HCl，1～5%?吐温?20，pH9.0；c、第二次洗涤：配制洗涤缓冲液Ⅱ，按5～15：1（V/W）加入步骤b处理后的包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力为5～15?bar，透过通量为10～30?LMH，包涵体悬液被浓缩3～5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液Ⅱ的组成为20～100?mM?Tris?HCl，2～4?M?尿素，pH9.0，或者组成为20～100?mM?Tris?HCl，1～3?M?盐酸胍，pH9.0；d、第三次洗涤：配制洗涤缓冲液Ⅲ，按5～15：1（V/W）加入步骤c处理后的包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力为5～15?bar，透过通量为10～30?LMH，包涵体悬液被浓缩3～5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液Ⅲ的组成为20～100?mM?Tris?HCl，pH9.0。...

【技术特征摘要】
1.一种基因工程包涵体的洗涤方法，其特征在于包括如下步骤a、膜平衡取中空纤维膜，用纯化水润洗平衡，调整进水流速使过膜压力为5 15 bar，透过通量为10 30 LMH ；b、第一次洗涤配制洗涤缓冲液I，按5 15:1 (V/W)加入包涵体，搅拌使成悬浮液， 将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力为5 15 bar，透过通量为10 30 LMH, 包涵体悬液被浓缩3 5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液I的组成为 20 100 mM Tris-HCl，I 5% 曲拉通-Χ-100，ρΗ9· 0，或者组成为 20 100 mM Tris-HCl，I 5% 吐温-20，pH9. O ；C、第二次洗涤配制洗涤缓冲液II，按5 15 :1 (V/W)加入步骤b处理后的包涵体浓缩液，搅拌使成悬浮液，将包涵体悬液泵进所述中空纤维膜，使过膜压力为5 15 bar，透过通量为10 30 LMH,包涵体悬液被浓缩3 5倍后停止进液，收集包涵体浓缩液；所述洗涤缓冲液II的组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵志全，熊继元，柳常青，
申请(专利权)人：鲁南新时代生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：