一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法技术

本发明专利技术阐述了一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，即以研究室保藏产硫酸软骨素菌株为生产菌株，在7L罐中发酵后收集发酵液，将发酵液进行预处理，然后用乙醇沉淀和氯仿萃取去除发酵液中的蛋白质等杂质，再利用超滤离心管反复三次离心除去发酵液中的小分子物质，最后将浓缩液真空冷冻干燥48h得到硫酸软骨素纯品。本发明专利技术经过浓缩后大大节约了使用乙醇的量，氯仿可以回收利用，同时使用超滤离心管对于小量制备硫酸软骨素纯品更加快捷、方便。

【技术实现步骤摘要】

一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，属于生物工程领域，特别是从发酵液中而非动物中提取硫酸软骨素。
技术介绍
硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)是一种酸性的黏多糖，其二糖单体由葡糖醛酸(D-GlcUA)与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)以β-1，3键相连，糖链生成后由磺基转移酶在GalNAc的碳4位或碳6位进行硫酸化，如图1。根据其化学组成和结构差异可分为A、B、C、D、E、F、H等多种，通常从哺乳动物组织中提取得到的硫酸软骨素以CS-A、CS-C为主。CS是一类重要的生物高分子，具有广泛的生物活性，其作为安全有效的保健食品和药品在世界各国得到了广泛应用。硫酸软骨素具有以下生物活性：镇痛抗炎作用；促进成骨细胞增生，诱导新骨形成；抗肿瘤作用；抗粘连作用；免疫调节作用；调血脂、抗动脉粥样硬化作用；抗氧化、清除自由基和廷缓衰老的作用。CS还具有抗炎、抗病毒、抗过敏和加速伤口愈合的作用，如抗HIV活性。在欧、美、日等发达国家，硫酸软骨素作为保健品长期应用于防治冠心病、心绞痛、心肌梗塞、冠状动脉机能不全、心肌缺血等疾病，无明显的毒副作用，能显著降低冠心病患者的发病率和死亡率。现今硫酸软骨素工业生产方法是从猪、牛、鸡、鲨鱼等动物软骨中提取，主要使用酶法和碱法相结合的方法，但是该方法存在收集原料的成本高、质量不稳定、纯度不好控制、提取复杂、生产造成污染等诸多问题。发酵法生产CS不受原材料限制，成本低、环境友好，r>但是尚处于初级阶段，国内使用发酵法生产硫酸软骨素尚属空白，国外有发酵液中小量制备硫酸软骨素类似物的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种发酵液中提取硫酸软骨的方法，该提取方法具有回收率高、提取简单、环境友好等优点。本专利技术的技术方案：1、发酵液的制备取0.1mL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中，培养温度为37℃，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养12h后按照10％接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵，培养温度为37℃，装液量为3L/7L，转速为400rpm，通气量为1.7L/min，发酵周期为24h。菌种：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)是由本研究室选育，主要用来生产硫酸软骨素，该菌株已申请中国专利，并且进入实质性审查，申请号为201110127831.1。种子培养基：葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K2HPO4·3H2O 0.04％，KH2PO40.04％。发酵培养基：葡萄糖2％，酵母粉5％，(NH4)2SO40.2％，K2HPO40.15％，KH2PO4·3H2O0.15％，MgSO4·7H2O 0.04％，MnCl2·4H2O 0.02％。2、发酵液中样品分离纯化1)取发酵液在旋转蒸发仪中45℃进行浓缩，将发酵液体积浓缩至原来的三分之。用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体；2)取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7-1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h虹吸部分上清液，残余液离心20min，收集沉淀，重复上述过程2次；3)加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于适量去离子水中；4)得到的提纯样品在超滤离心管中离心浓缩，超滤离心管的过滤膜截留分子量为10kDa，5000rpm离心浓缩至原体积的十分之一，再将浓缩液加入去离子水至原体积，再次进行超滤离心，反复三次除去发酵液中小分子物质和有机溶剂。将得到浓缩液至于平板中，放置于-70℃超低温冰箱中冷冻，然后进行冷冻干燥浓缩液后得到硫酸软骨素纯品。3、硫酸软骨素含量的测定将提纯样品稀释合适倍数与标准溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定硫酸软骨素的含量。色谱条件：色谱柱：NUCLEODUR C18Pyramid；流动相：乙腈+戊烷磺酸钠(10+90)；柱温：35℃；检测波长：192nm；进样量：10μL流速：0.8ml/min。液相色谱标准样品通过高效液相色谱的检测结果如图2，提纯样品检测结果如图3。附图说明图1硫酸软骨素的结构式，R和R1相同或不同，代表H或SO3Na，但不能同时为H，n＝5-50图2鲨鱼软骨素标准品的高相液相色谱结果图3硫酸软骨素提纯样品高效液相色谱结果具体实施方式实施例1：按照常规动物软骨中提取硫酸软骨素的方法，硫酸软骨素含量为3.5g/L的发酵液1L离心除去菌体，置于含碱性蛋白酶(5％)的50mmol/L碳酸钠缓冲液中，60℃保温12h，加热煮沸10min灭活蛋白酶后冷却至4℃。处理液中加6.1mol/L三氯醋酸溶液使浓度为5％(v/v)沉淀蛋白质，4℃离心除去。溶液加乙醇至80％(v/v)沉淀24h，4℃离心分离。沉淀溶于水，与氯化十六烷基吡啶混合终达1％(w/v)，室温1h，4℃离心收集沉淀。沉淀溶于2.5mol/L氯化钠，乙醇再沉淀(80％，v/v)，4℃离心。最后的沉淀再溶于水，4℃透析48h，冻干得产品。该方法操作相对简单，但是回收率低，回收硫酸软骨素冻干质量为2.60g，回收率为74％。实施例2：收集发酵液，用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体。取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7-1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌30min，收集沉淀，重复上述过程2次。加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2-3倍的无水乙醇，搅拌3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于提取方法包括如下步骤：1)取0.1mL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtillis？BN)接种于种子培养基中，培养12h后按照10％接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵，发酵周期为24h。种子培养基：葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K2HPO4·3H2O？0.04％，KH2PO40.04％。发酵培养基：葡萄糖2％，酵母粉5％，(NH4)2SO40.2％，K2HPO40.15％，KH2PO4·3H2O？0.15％，MgSO4·7H2O？0.04％，MnCl2·4H2O？0.02％。2)取发酵液在旋转蒸发仪中进行浓缩，用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，再用5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体；3)取上清液，加入上清体积2？3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入0.7？1倍体积的氯仿，搅拌1h后静置3h，分液除去氯仿相，得上清液。再次加入上清体积2？3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h虹吸部分上清液，残余液离心20min，收集沉淀，重复上述过程2次；4)加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解加入胰蛋白酶50mg/L，低速搅拌12h，6000rpm离心20min，收集上清液再次加入上清体积2？3倍的无水乙醇，搅拌30min，静置24h，将提纯样品溶于适量去离子水中；5)去提纯样品适量于超滤离心管中，超滤离心同时去除小分子物质和有机溶剂，浓缩液加入去离子水至原体积，再次进行超滤离心，反复三次除去发酵液中小分子物质，浓缩液真空冷冻干燥后得到硫酸软骨素纯品。...

【技术特征摘要】
1.一种发酵液中提取硫酸软骨素的方法，其特征在于提取方法包括如下步骤：
1)取0.1mL筛选的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis BN)接种于种子培养基中，培养12h
后按照10％接种量接种于7L发酵罐中进行分批发酵，发酵周期为24h。
种子培养基：
葡萄糖1.5％，大豆蛋白胨0.8％，酵母粉0.8％，K2HPO4·3H2O 0.04％，KH2PO40.04％。
发酵培养基：
葡萄糖2％，酵母粉5％，(NH4)2SO40.2％，K2HPO40.15％，KH2PO4·3H2O 0.15％，MgSO4·7
H2O 0.04％，MnCl2·4H2O 0.02％。
2)取发酵液在旋转蒸发仪中进行浓缩，用三氯乙酸调pH至4.5，常温下静置1h，再用
5mol/L的NaOH调pH至6.0，8000rpm离心15min除去菌体；
3)取上清液，加入上清体积2-3倍的乙醇，机械搅拌1h后低温静置24h。倾去部分上清，
残余液在4000rpm下离心20min，收集沉淀，加入0.3mol/L的NaCl将沉淀充分溶解，加入
0.7-1倍体...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，刘佳，吴秋林，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：