本发明专利技术是一种利用仪器分析的方法对致病菌-副溶血弧菌进行准确鉴别的方法，突破了传统微生物采用传统生理生化实验和基因的检测鉴定方法，具有快速、准确特点。菌株在胰蛋白胨大豆培养14h，离心得到固体用3％盐水洗涤两次，加入30ml甲醇超声40min，离心取上清，干燥，用1ml甲醇回溶备用。取该样品20μL在色谱条件为：C18(4.6mm×25mm，5μm)；流动相A：乙腈；B：0.05％磷酸水溶液。梯度洗脱。紫外检测器的检测波长为：280nm；流速为：1mL/min；柱温：30℃分析，所得色谱图与副溶血弧菌指纹图谱进行比较，判断。从增菌培养到鉴定只需要16h。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是一种利用仪器分析的方法对致病菌-副溶血弧菌进行准确鉴别的方法，该法突破了传统微生物采用传统生理生化实验和基因的检测鉴定方法。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemoIyticus, VP)是世界范围内公认的一种重要的食源性病原菌，副溶血性弧菌是一种在河、海、港口等环境中自然生长的革兰氏阴性嗜盐菌，它广泛分布于海水及多种水产品中。近年来，副溶血性弧菌中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，中毒临床症状以典型的急性胃肠炎症状为主，严重患者可因抢救不 及时而死亡。食品中副溶血性弧菌的鉴定检测方法的国际、国家标准和行业标准，皆属于传统的培养及生化鉴定方法，要经过前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学反应等过程，鉴定周期5d-7d左右。该方法操作繁琐，鉴定副溶血性弧菌的时间长，周期长、工作量大。而分子方法，如PCR技术含量比较高，对操作、设备条件、工作环境均有较高的要求，并且容易出现假阳性，仍不能进行广泛的普及和推广。HPLC是在20世纪60年代末，以经典液相色谱法为基础，引入气相色谱的理论与实验方法发展而成的，具有应用范围广等优点，是目前指纹图谱研究中使用最多，技术最成熟的一类方法，如可运用二极管阵列检测器进行多波长检测，可同时得到不同波长检测的结果，并组成三维图谱，因而适用于组分复杂，各组分在紫外可见光区的特征吸收波长各异的中药材的分析，尤其对成份差别较细微的单味药材及成分较为复杂的复方制剂，其分离鉴定能力大大优于TLC ;而GC应用范围较仅限于分析挥发性物质的测定，因此近年来多种中药材的指纹图谱研究多采用高效液相色谱法。指纹图谱作为复杂体系鉴别检验方法在各领域逐步的被采纳和应用。目前关于副溶血弧菌的专利200710046637. 4 一种用于检测副溶血弧菌的方法、200510120893. 4 一种用于检测副溶血弧菌核苷酸片段的引物和探针序列、03146896. 9 一种快速检测副溶血弧菌的方法、200710042898. 9添有扩增内标的副溶血弧菌PCR检测方法和200810238409. I水产品中副溶血弧菌的PCR-ELISA检测方法均是以分子、PCR和ELISA的方法对副溶血弧菌进行检测和鉴别，均存在假阳性和检测条件要求较为苛刻。
技术实现思路
本专利技术采用高效液相色谱法对副溶血性弧菌标准菌株(ATCC17802)的鉴定方法，进行了初步的开发、评价和摸索，并用12株副溶血性弧菌、16株弧菌属的非副溶血菌株，以及17株非弧菌属的菌株包括大部分致病菌进行了特异性分析。在指纹图谱构建过程中，分别对副溶血性弧菌胞内提取物的提取条件进行了研究，考察了不同培养基，不同培养时间，前处理溶液选择等条件对副溶血性弧菌指纹图谱的影响。I、副溶血弧菌指纹图谱液相流动相的确定经过不同流动相图谱比较，得出使用乙腈时，分离较好的峰有15个。使用甲醇分离到10个峰，使用乙腈比使用甲醇分离的物质多，最终选用乙腈。酸性水溶液有利于改善峰形防止拖尾。在反相色谱分离多肽和蛋白质的实验中，使用酸性物质作为离子对试剂是常见的手段。流动相中的酸通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问题。与多肽上的正电荷及极性基团相结合以减少极性保留，并把多肽带回到疏水的反相表面。以同样的方式，它屏蔽了固定相上残留的极性表面。由于副溶血性弧菌胞内特征性物质多为蛋白质，因此试用不同的酸。比较流动相为乙腈-O. 05%三氟乙酸水溶液和流动相为乙腈-O. 05%磷酸水溶液。两个色谱谱大小峰形基本一致，由于三氟乙酸毒性挥发性都强于磷酸，因此最终选用乙腈-O. 05%磷酸水溶液最为流动相。2检测波长的确定本试验采用二极管阵列检测器对副溶血弧菌胞内提取物进行波长扫描，扫描波长段为200 400nm。得到不同物质在不同波长下最大吸收，从而进一步从中选取260nm、270nm、280nm、290nm进行图谱分析结果显示在280nm条件下色谱峰响应值亦较大，结果显示可知280nm条件下峰数最多，因此选择280nm作为指纹图谱检测波长。 3流动相流速和色谱柱温度确定实验结果表明流速不是影响保留时间的唯一因素，但改变流速会影响峰形和出峰时间，当流速为I. 2ml/min时,许多成分同时被洗脱出来,无法实现有效分离。当流速O. 8ml/min时，出峰慢,峰型又矮又胖,峰面积可能会变宽，峰高变小，拖尾。本专利技术分别尝试采用25°C、30°C、35°C，40°C柱温，结果表明，色谱的过程是靠流动相中的样品和固定相的结合-分离差异达到分离物质的作用，温度可以影响结合-分离过程，从而影响色谱过程。柱温越高时加快分离过程，出峰越快，保留时间越短，有些组份分离度不够。柱温低，分离度提高，但分离过程时间加长。由于在不同条件下，0_5min之间的色谱峰无法实现基本分离，分离度(R)均小于1，因此实验对5-40min之间的峰面积大于10的14个色谱峰，两两相邻两组份的色谱峰分别进行了分离度计算，最终得到在不同流速和色谱柱温度下，R ^ I. 5的色谱峰个数(η)进行了统计结果显示，当流速为I. Oml/min时,η为12,最终选择流动相的流速为I. Oml/min。考虑到气温对柱温箱有一定的影响，当室温过高时，而柱温箱设定温度低时将无法达到柱温要求，最终选择柱温为30°C。4进样量确定当测的某种成分响应值偏低时，应加大浓度，或加大进样量，大进样量可能会使峰展宽，因此本实验先采用加大进样量的方法，进样量分别采用10μ 1、20μ I。由于细菌个体微小，胞内物质含量极少，结果显示，当进样量越大时，峰越高，峰面积越大，图谱就越清楚，而峰并没有展宽。因此最终选择加大进样量的方法，由于本实验室所用液相色谱仪的最大量程20 μ I进样。当进样量为最大量程时，采取大量程进样器吸取多于20 μ I待测液注入进样环，以保证20μ I进样环中的待测液体为准确的20 μ 1，从而保证进样量准确无误，以及图谱良好的重复性。6培养基优化由于营养肉汤培养基在培养细菌方面应用广泛，因此本专利技术首先米用营养肉汤进行副溶血性弧菌培养，但经过培养实验发现，副溶血性弧菌在营养肉汤中生长缓慢，因此采样胰蛋白胨大豆液体培养基，此培养基营养丰富，对某些较难生长的细菌均能生长，并且也可用于各种细菌的增殖培养，亦可用作基础培养基。培养结果发现相同的接种量，副溶血性弧菌在此培养基中培养12h菌液浓度可达到108cfu/mL，而用营养肉汤培养15h才能达到该浓度，又通过色谱图得到用该培养基胞内物质种类多样，因此最终选择用胰蛋白胨大豆液体培养基培养副溶血性弧菌。7梯度洗脱程序条件最终确定根据以上条件的摸索结果发现，由于培养基的变化使得提取出的副溶血性弧菌的胞内物质种类增多，原有的分离条件不足以使主要色谱峰分离开，所以需要对流动相梯度进一步优化。副溶血性弧菌指纹图谱建立条件优化为流动相A为乙腈，流动相B为O. 05%磷酸水溶液，波长为280nm，柱温为30°C，进样量为20 μ I。流动相梯度见表I :表I流动相梯度·__乙腈比例_0.05%磷酸溶液比例_流速(mAmin) 0-5min 5% 95% I5-20min 65% 35% I20-25min 80% 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
未知菌前处理条：将未知菌题接种在100ml胰蛋白胨大豆液体培养基，过夜培养14h，4000转离心去上清，用3％盐水洗涤两次，加入30ml甲醇超声40min，再进行4000转离心取上清，抽滤干燥，最终用1ml甲醇回溶；
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，田益玲，施惠，王颉，于志彬，李宁，王羽，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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