一种香精香料中四种禁用成分（马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯）含量的测定方法，包括样品溶液的制备，液相色谱分析及测定结果的计算等步骤。本发明专利技术的检测方法经优化之后具有检测时间短、操作简便、灵敏度高、回收率高及重复性好等优点，本发明专利技术方法的色谱条件使马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯色谱峰与杂质色谱峰分离较好，并且具有较好的相关性，检测限在0.04~0.34μg/g之间，平均回收率分别为94.01％、95.96％、86.48%和84.28％，样品测试结果的平均相对标准偏差分别为4.40%、2.39％、2.49%和3.35％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于香精香料的理化检验
，具体涉及香精香料中四种禁用成分马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯含量的测定方法，
技术介绍
马兜铃酸是碳环芳香族酸性化合物，基本骨架构成为蒽菲型结构，主要存在于马兜铃科植物中。早期发现该类物质具有抗肿瘤活性、抗感染及增强吞噬细胞活性等作用。随着研究的深入，马兜铃酸类物质已被证实具有肾毒、致癌和致基因突变作用。马兜铃酸与肾病讨论由来已久，1964年我国吴松寒首次报道了两例病人因服用大剂量木通(含马兜铃酸)导致急性肾功能衰竭，此后陆续有相关的报道，但未引起广泛关注。1993年，比利·时学者Vanherweghem等首先发现2例女性服中草药减肥治疗后，出现慢性肾损害，病理组织学证实为快速进展的肾间质纤维化，经薄层色谱仪分析发现减肥胶囊中含马兜铃酸(aristolochic acid, AAs)。至1998年欧洲已有100余人因服该减肥药导致慢性肾损害，其中1/3已接受肾移植；1999年英国报道了两例因摄入木通而导致的晚期肾衰竭病例。由于有了这些病例，国内外才提出禁止马兜铃酸在药品和食品中使用的相关政策。从1999年7月29日，英国宣布禁止销售和使用含马兜铃酸的中药。2000年6月9日，美国药品与食品管理局(FDA)在至今未收到类似不利事件报告的情况下，命令停止进口、制造和销售已知含有和怀疑含有马兜铃酸的原料和成品，导致多达70余种中药被列入黑名单。2000年11月，世界卫生组织(World Health Organization,简称WHO)在其药物通讯中发出类似警告，西班牙、奥地利、埃及、马来西亚、菲律宾、日本等国纷纷效仿。2003年4月，我国国家食品药品监督管理局(State Food and Drug Administration,简写为SDA)取消了木通的药用标准。2004年8月又取消了广防己、青木香的药用标准，并对含马兜铃、寻骨风、天仙藤和朱砂莲的中药制剂严格按处方药管理。水杨酸是一种植物激素，对植物生长发育过程及植物抗药性方面有调控作用，可以延缓多种果实成熟衰老进程。而且水杨酸具有一定的抑菌作用，在医药化工中用于消毒和治疗各种慢性皮肤病。另外，水杨酸还具有去角质、促进皮肤代谢的功效，在化妆品行业中也广泛使用。但是水杨酸在人体内会氧化为草酸，引起中毒，被列为食品禁用防腐剂。而且水杨酸对皮肤具有刺激性，严重可导致皮炎。对眼睛刺激性大，其半数致死量LD50 (大鼠，口服)为891 mg/kg ；LD50 (肌肉，静脉注射)为500 mg/kg。美国食品药品管理局、美国皮肤病学会认为水杨酸的外用安全浓度是0.5-2. O %。中国食品药品管理局也规定了护肤品中水杨酸的上限为2 %。正二氢愈疮酸具有多种生物活性，包括抑制脂氧化酶、乳头状瘤病毒、单纯疱疹病毒、HIV及降血糖作用、人脑恶性胶质瘤的治疗作用。Larreatridentate Coville灌木的叶子、茎被制作成胶囊，发现早期被应用到膳食中。然而，在饮用了含有正二氢愈疮酸的茶叶或是食用了含有5 - 10%干重的正二氢愈疮酸胶囊后，出现了非感染性肝炎的病例，同时研究报告结论表明过量摄入正二氢愈疮酸会导致肾损伤。通过机理方面的研究表明，正二氢愈疮酸作为抗氧化剂，其具有治疗优势。但是其他一些报告也显示出正二氢愈疮酸作为抗氧化剂具有潜在的毒性、致癌性和致突变性。在最近的一些研究发现在低剂量的测试中，正二氢愈疮酸对DNA的合成有优先的抑制作用；在高剂量的测试中，对蛋白质的合成有明显的抑制作用。 邻氨基苯甲酸肉桂酯具香脂膏香、水果香气，带棕褐色粉末。略带棕色粉状体。有似葡萄糖的果香和膏香。熔点大于60°C;d I. 18(15. 5°C );沸点332°C /IO50在60多年前此化合物已用于食品和日化用品的加香，此化合物已经被认证对公众健康无害的人造香味料。但是邻氨基苯甲酸肉桂酯可燃，燃烧可形成有毒的氮氧化合物。关于马兜铃酸的检测，早期方法出现于1975年，Rao. K. V等人采用荧光分光光度计和气液色谱建立了马兜铃酸检测方法。1988年中华人民共和国药典中，测定马兜铃酸的方法为薄层色谱方法；1989年开始，多种针对不同来源样品的高效液相色谱(HPLC)测定马兜铃酸方法被建立；2002年，Kite，G.C.等人采用液相色谱二级质谱(LC-MS/MS)的方法建立了马兜铃酸检测方法，并采用该方法开展了定性和定量工作。此外，在早期测定马兜铃酸的方法还出现了分光光度法、极谱法，由于分光光度法和极谱法存在专属性较差、检测限较高等原因，目前这两种检测方法应用较少。正二氢愈疮酸的主流分析方法包括高效液相色谱质谱检测器方法(HPLC-MS/MS)、高效液相色谱紫外检测器方法(HPLC-DAD)、微池毛细管电泳色谱安培检测器方法和高效液相色谱荧光检测器方法(HPLC-FLD)等，这些方法的共性即是用高效液相色谱或毛细管色谱进行分离，采用质谱、紫外或荧光检测器进行检测。水杨酸的检测方法有五种类型，它们包括液相色谱法、分光光度法、流动注射分析法、离子色谱法、化学发光法等。测定水杨酸的分析方法中较为经典的方法是上世纪七十年代AOAC根据水杨酸和铁离子(Fe3+)生成紫堇色的络合物，并采用分光光度法测定有色络合物的分析方法，该方法是适用于食品中水杨酸测定。美国药典32版(USP32)中，建立了水杨酸的液相色谱测定方法，该方法采用液相分离，紫外检测器采集270 nm紫外波长的方法检测了药品中的水杨酸。田兰等考察了不同PH值条件下流动相对峰分离度和峰形的影响，发现当PH值为3时，分离效果最好。李效宽等对多种流动相体系进行了比较，发现采用甲醇/0. 02 mol/L磷酸二氢钾溶液(体积比，40:60)(磷酸调pH至3. O)为流动相时，分离效果最好。随着现代分析仪器技术的发展，出现了 LC-MS测定水杨酸的分析方法。2005年SiskaC等利用LC-MS对动物组织中的水杨酸和代谢物进行定量测定Jiri G等用UPLC-MS/MS检测饮料中包括水杨酸在内的17种酚酸，分析时间在12 min以内，大大提高了分析效率和分析结果的准确性。同时，由于液质联用高灵敏度特点，因此液质联用方法也是目前测定水杨酸灵敏度较高的检测方法。目前关于邻氨基苯甲酸肉桂酯的测定方法国内外研究极少。Demers等人曾用高效液相色谱荧光检测法测定了香水及花露水中的邻氨基苯甲酸肉桂酯，Sherma等做过类似的研究，二者的测定结果均较为理想；Keyhanfar等同样用高效液相色谱荧光检测法测定了小鼠体内的邻氨基苯甲酸肉桂酯及其代谢物，测定结果符合定量分析的要求。目前，国内外公开文献暂无关于这四种禁用成分的同时检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的正是基于上述状况，通过长期的研究和探索，在方法对比、优化的基础上，提出了一种香精香料中四种禁用成分(马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯)含量的测定方法，用于检测香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的含量。本专利技术考察研究了香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的萃取条件，优化了色谱分离的条件，为简便、快速有效的测定香精香料中上述四种禁用成分残留的含量提供了技本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种香精香料中四种禁用成分马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯含量的同时测定方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）萃取溶液的配制：称取1g的抗坏血酸加入到1L的容量瓶中，用0.1%的甲酸甲醇?水的混合溶液定容，甲醇与水的体积比为9:1；（2）标准溶液的配制：用萃取溶液分别配制具有浓度梯度的马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯的标准工作溶液；（3）样品溶液的制备：使用萃取溶液振荡萃取样品，然后离心过滤制备样品溶液；（4）液相色谱分析：利用液相色谱仪分别对标准溶液和样品溶液进行检测分析；（5）香精香料中马兜铃酸、水杨酸、正二氢愈创酸和邻氨基苯甲酸肉桂酯含量的计算。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张洪非，唐纲岭，边照阳，陈再根，刘洋，杨飞，刘楠，刘珊珊，李中皓，姜兴益，孙莹莹，邢军，胡清源，
申请(专利权)人：国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：
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