本发明专利技术公开了一种胰蛋白酶检测方法，步骤如下：将胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒反应，得到反应产物；检测反应产物中核-壳型纳米颗粒的吸光值；检测反应产物中金属纳米粒子的吸光值；计算金属纳米粒子的吸光值与核-壳型纳米颗粒的吸光值的比值，根据标准曲线得到胰蛋白酶的含量；其中，所述的核-壳型纳米颗粒为蛋白质或多肽包被金属形成。本发明专利技术还提供了所述核-壳型纳米颗粒的制备方法。本发明专利技术提供的胰蛋白酶检测方法操作简单，且无需对探针进行修饰或标记。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质检测领域，尤其涉及。
技术介绍
蛋白酶能够催化水解靶蛋白中的特异性肽键，涉及调控重要的生理、病理过程。胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的水解酶，可将肽链中赖氨酸和精氨酸残基的羧基端切断，胰蛋白酶在医药、食品及工业生产中均有应用，能溶解变形蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，能使脓液、痰液、血凝块等分解、变稀，加速创面净化，还有抗炎的作用；临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等；胰蛋白酶在促进其他胰腺酶原活化，控制胰腺外分泌功能中具有重要作用；胰蛋白酶的升高是急性酒精 性胰腺炎最准确的指示器；胰蛋白酶的缺乏或变异将会引起胎粪性肠梗塞、遗传性胰腺炎等胰腺疾病。因此胰蛋白酶的检测在健康、医药和食品质量控制中具有重要的作用。现有技术中胰蛋白酶的检测方法主要有荧光法、电化学法、比色法。荧光法一般需要选择合适的荧光标记物，并要对探针进行荧光标记，电化学方法涉及复杂的电极修饰，步骤繁琐。金属与蛋白质结合成为金属纳米簇，当金属纳米簇与胰蛋白酶混合时，金属纳米簇中的蛋白质被胰蛋白酶水解后与金属分离，分离后的金属粒子会发生团聚，溶液的颜色会发生改变，可通过比色来实现胰蛋白酶的检测，如Lin等(Biomaterials, 2010, 31,6087-6095)将胰蛋白酶底物和1_巯基己醇吸附在金纳米颗粒表面，当胰蛋白酶水解底物，金纳米颗粒的稳定环境被破坏，产生聚集；Zhang等(Analyst, 2011,136, 3136-3141)基于短的聚精氨酸(Arg6)能够诱导金纳米颗粒聚集，而聚精氨酸被胰蛋白酶水解为小的片段后不能诱导金纳米颗粒聚集。比色方法无需修饰和标记，相对简单，易于操作。
技术实现思路
本专利技术旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种利用比色进行胰蛋白酶检测的方法，步骤简单，易于操作。本专利技术提供了一种胰蛋白酶检测方法，包括以下步骤将胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒反应，得到反应产物；检测反应产物中核-壳型纳米颗粒的吸光值；检测反应产物中金属纳米粒子的吸光值；计算金属纳米粒子的吸光值与核-壳型纳米颗粒的吸光值的比值，根据标准曲线得到胰蛋白酶的含量；其中，所述的核-壳型纳米颗粒为蛋白质或多肽包被金属纳米粒子形成。 优选地，所述的核-壳型纳米颗粒选自多聚赖氨酸-金纳米颗粒、多聚赖氨酸-银纳米颗粒、多聚精氨酸-金纳米颗粒或多聚精氨酸-银纳米颗粒。优选地，所述的反应温度为30_40°C。优选地，所述的反应时间为l_2h。优选地，所述的反应温度为37°C，反应时间为2h。优选地，所述的核-壳型纳米颗粒中金属的物质的量与蛋白质的质量比为(5-50)μ moI : (5-50)mg。优选地，所述的核-壳型纳米颗粒中金属的物质的量与蛋白质的质量比为I μ mo I : Img0优选地，所述的核-壳型纳米颗粒按照以下方法制备将金属离子和蛋白质或多肽混合，得到混合溶液；将混合溶液放置于50-70°C下孵育O. 5_3h。优选地，所述的混合溶液放置于65°C下孵育3h。 本专利技术的胰蛋白酶检测方法利用蛋白质或多肽包被金属形成核-壳型纳米颗粒，既作为胰蛋白酶作用的底物，又作为颜色变化的指示剂，未加入胰蛋白酶时，溶液显示的为核-壳型纳米颗粒的颜色，当与胰蛋白酶混合后，核-壳型纳米颗粒表面的蛋白质被水解，核-壳型纳米颗粒结构被破坏，金属核心暴露并发生聚集，形成金属纳米粒子，溶液的颜色发生变化，核-壳型纳米颗粒的颜色变浅，金属纳米粒子的颜色得到显现，利用这两种颜色吸光值的比值表征核-壳型纳米颗粒的减少量，即蛋白质被水解的量，即也表征胰蛋白酶的含量。本专利技术的有益效果在于，本专利技术提供的胰蛋白酶检测方法操作简单，且无需对探针进行修饰或标记。附图说明图I是实施例I中制备的核-壳型纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱。图2是实施例I中制备的核-壳型纳米颗粒的粒径分布图。图3是实施例I中的胰蛋白酶浓度与吸光度比值的标准曲线图。图4是实施例2中的胰蛋白酶浓度与吸光度比值的标准曲线图。图5是实施例3中的胰蛋白酶浓度与吸光度比值的标准曲线图。图6是实施例5中胰蛋白酶检测的特异性对比图。具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好的理解本申请的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。本专利技术提供了，包括以下步骤将胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒反应，得到反应产物；检测反应产物中核-壳型纳米颗粒的吸光值；检测反应产物中金属纳米粒子的吸光值；计算金属纳米粒子的吸光值与核-壳型纳米颗粒的吸光值的比值，根据标准曲线得到胰蛋白酶的含量；其中，所述的核-壳型纳米颗粒为蛋白质或多肽包被金属形成。胰蛋白酶为蛋白水解酶的一种，能够选择性的水解蛋白质，只作用于精氨酸和赖氨酸的羧基端，在医药、食品、工业生产中都有着广泛的应用。本专利技术以核-壳型纳米颗粒作为颜色变化的指示剂，利用胰蛋白酶水解核-壳型纳米颗粒中的蛋白质后金属发生聚集形成金属纳米粒子，产生颜色变化，利用比色法对胰蛋白酶进行检测。本专利技术的检测方法中所述的核-壳型纳米颗粒优选按照以下方法制备将金属离子和蛋白质混合，得到混合溶液；将混合溶液放置于50_70°C下孵育O. 5_3h。优选地，所述的混合溶液放置于65°C下孵育3h。核-壳型纳米颗粒是一种由金属作为核心，蛋白质或多肽分子作为保护基团组装 而成的核-壳型纳米颗粒，为水溶性，在可见光到近红外光区范围内可发射光谱，还具有生物相容性好、光稳定性强等优点。本专利技术中金属优选为金离子或银离子，更优选为金离子，最优选为氯金酸中的金离子；所述的蛋白质或多肽优选为多聚精氨酸或多聚赖氨酸，更优选为多聚赖氨酸；所述的金属的物质的量与蛋白质或多肽的质量比优选为(5-50) μ mol (5-50)mg，更优选为(25-50) μ mo I : (25-50) mg,最优选为 I μ mo I : Img。得到混合溶液后，将混合溶液置于50_70°C下孵育O. 5_3h，更优选为65_70°C下孵育O. 5-3h，最优选为65°C下孵育3h，反应后得到本专利技术的核-壳型纳米颗粒。得到核-壳型纳米颗粒后，将胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒混合，核-壳型纳米颗粒优选为多聚赖氨酸-金纳米颗粒、多聚赖氨酸-银纳米颗粒、多聚精氨酸-金纳米颗粒或多聚精氨酸-银纳米颗粒，更优选为多聚赖氨酸-金纳米颗粒、多聚赖氨酸-银纳米颗粒，最优选为多聚赖氨酸-金纳米颗粒；胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒混合反应温度采用本领域技术人员熟知的胰蛋白酶最适温度，优选为30-40°C，更优选为37°C ;胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒混合反应时间优选为l_2h，更优选为2h。反应完毕后，得到反应产物，检测核-壳型纳米颗粒和金属纳米粒子的吸光值，所述的核-壳型纳米颗粒测定波长优选为核-壳型纳米颗粒紫外-可见光吸收光谱中吸光值得到最大值时对应的波长，金属纳米粒子测定波长优选为金属纳米粒子紫外-可见光吸收光谱中吸光值得到最大值时对应的波长。根据上述技术方案得到核-壳型纳米颗粒和金属纳米粒子的吸光值后，计算所述金属纳米粒子与核-壳型纳米颗粒吸光值的比值，根据所述比值与标准曲线对比，得到胰蛋白酶的含量。其中，所述的标准曲线中金属纳米粒子与核-壳型纳米颗粒吸光值的检测与本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种胰蛋白酶检测方法，包括以下步骤：将胰蛋白酶与核?壳型纳米颗粒反应，得到反应产物；检测反应产物中核?壳型纳米颗粒的吸光值；检测反应产物中金属纳米粒子的吸光值；计算金属纳米粒子的吸光值与核?壳型纳米颗粒的吸光值的比值，根据标准曲线得到胰蛋白酶的含量；其中，所述的核?壳型纳米颗粒为蛋白质或多肽包被金属形成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林涛，武春雷，张鹏飞，粟武，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
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