生产重组胰蛋白酶的方法技术

本发明专利技术涉及生产来自猪胰的重组胰蛋白酶的方法，该胰蛋白酶在巴斯德毕氏酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）中是可溶的且分泌到培养基中，其中在ｐＨ　３．０－４．０的表达防止了胰蛋白酶原到β胰蛋白酶的活化和β胰蛋白酶由胰蛋白酶自溶为ε胰蛋白酶及由此变为失活的肽。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及重组生产胰蛋白酶的方法。为此目的，优选使具有缩短的前肽序列的胰蛋白酶原在重组的宿主细胞内表达并以未切割的形式分泌到培养基中。随后进行经控制的前肽切割以形成活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，该酶催化在碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸的羧基基团上进行肽的水解切割(Keil B.，1971)。来自牛胰的胰蛋白酶是最早可以以纯的形式和足够的量用于提取化学和酶的研究的蛋白水解酶之一(Northrop等人，1948)。随后可归类于胰蛋白酶家族的蛋白酶也可以从其他高等脊椎动物中分离(猪-Charles等人，1963/绵羊-Bricteux-Gregoire等人(1966)；Travis(1968)/火鸡-Ryan(1965)/人-Travis等人(1969)等)。当时也在两个链霉菌(streptomyces)物种中分离了第一个属于胰蛋白酶家族的酶(Morihara和Tsuzuki(1968)；Trop和Birk(1968)；W_hlby和Engstr_m(1968)；W_hlby(1968)；Jurasek等人(1969))。该酶是作为无活性的前体(胰蛋白酶原)在脊椎动物的胰细胞中合成的，并随后通过对前肽的切割而转变为活性形式(Northrop等人(1948)；Desnuelle(1959))。第一个胰蛋白酶原分子是以天然的方式通过在(Asp4)-Lys-↓-Ile间水解肽键从而切除前肽的肠肽酶肠激酶来活化的(Keil(1971))。肠激酶(Asp4)-Lys的识别序列在几乎所有的以前已知的胰蛋白酶原分子中直接位于前肽的C-末端(Light等人(1980))。活化反应也可在生理pH值下自身催化地进行，这是因为有一个赖氨酸位于肠激酶的识别序列的C-末端侧，因此Lys-↓-Ile肽键水解也可通过胰蛋白酶进行(Light等人(1980))。胰蛋白酶由于其易于从多种哺乳动物获得、高的特异性(仅在赖氨酸或精氨酸的C-末端进行切割)和高的特异活性(～150U/mg)以及其良好的贮藏稳定性，所以始终是生物技术应用中有价值的蛋白酶。胰蛋白酶主要用于将肽用胰蛋白酶切割为用于测序的小段、用于使贴壁细胞从被覆盖的细胞培养物皿上脱离及用于将融合蛋白质切割为目标肽和融合成分、用于活化前肽(如胰蛋白酶原到胰蛋白酶)及用于肽激素的重组生产(如前胰岛素到胰岛素，在此参见WO 99/10503)。胰蛋白酶也是一些药物制剂的成分(药膏、糖衣丸和用于吸入的气雾剂(Rote Liste，1997；The United States Pharmacopeia，The NationalFormulary，USP23-NF18，1995))。由于动物来源的酶的使用在许多情况下(潜在的感染因素的污染)已经不再被允许，对于想要的生物技术应用必须提供来自微生物宿主的重组胰蛋白酶。已知有几种从不同的生物中重组生产胰蛋白酶的方法。Graf，L.等人(1987和1988)描述了大鼠胰蛋白酶和胰蛋白酶原突变体在大肠杆菌(E.coli)中的表达和分泌。为了将胰蛋白酶原分子分泌到大肠杆菌的周质，将细菌碱性磷酸酶(phoA)的信号序列置换天然的胰蛋白酶原信号序列。分泌的无活性胰蛋白酶原分子是从周质中分离的，并通过用纯化的肠激酶进行酶促切割而活化。Vasquez，J.R.等人(1989)描述了阴离子大鼠胰蛋白酶和胰蛋白酶突变体在大肠杆菌中的表达和分泌。为了使活性的胰蛋白酶分子表达和分泌到大肠杆菌的周质，将天然的胰蛋白酶原前区段原(Prepro-Segment)(信号序列和活化肽)通过细菌碱性磷酸酶(phoA)的信号序列进行置换并使用了可由磷酸盐调节的phoA启动子。活性的胰蛋白酶是从周质分离的。然而产率非常低(约1mg/l)。Higaki，J.N.等人(1989)描述了胰蛋白酶和胰蛋白酶突变体用tac启动子和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)hisJ信号序列表达并分泌到大肠杆菌周质中。活性胰蛋白酶的产率为约0.3mg/l。活性的阴离子大鼠胰蛋白酶的体积产率可通过高细胞密度的催化增加到约50mg/l(Yee，L.和Blanch，H.W.，(1993))。然而，作者提到了活性胰蛋白酶在大肠杆菌中表达和分泌的问题。酶促的活性胰蛋白酶是在切割了信号序列且天然的胰蛋白酶蛋白质折叠形成6个二硫键之后在大肠杆菌的周质中形成的。活性胰蛋白酶的形成对于细胞是毒性的，这是因为活性胰蛋白酶水解周质中的大肠杆菌蛋白质并致使细胞溶解。此外，胰蛋白酶的蛋白质折叠，特别是6个二硫键正确的天然形成在大肠杆菌周质中是很难发生的。该系统不适用于分离较大量的胰蛋白酶(＞10mg；Willett，E.S.等人(1995))。为了生产较大量的胰蛋白酶(50-100mg)用于X-射线晶体学研究，在可调节的ADH/GAPDH启动子控制下并通过与酵母α因子前导肽融合在酵母中分泌无活性的胰蛋白酶原前体。分泌到培养基中的表达产物是在体外依靠肠激酶定量地转变为胰蛋白酶的。产率为10-15mg/l(Hedstrom，L.等人(1992))。编码带有起始甲硫氨酸残基的成熟牛胰蛋白酶和牛胰蛋白酶原的基因序列描述于EP 0 597 681中。此外，也描述了在大肠杆菌中的表达，但对于活性胰蛋白酶如何在大肠杆菌中形成的策略未作解释。一种在曲霉属中用重组方法生产来自猪胰的胰蛋白酶或其衍生物的方法描述于WO 97/00316中。使用了一种转化载体，该载体为胰蛋白酶原或其衍生物如此编码，即其N-末端与功能信号肽融合。酵母培养物与曲霉属培养物相比达到了较高的生物量浓度，且生长明显较快，以致为了获得经济的表达方法所必需的产率，每个酵母细胞的特异性表达能力可比曲霉属细胞小。一种蛋白酶酶原前体重组生产的方法描述于WO 99/10503中，该前体含有一个天然不存在的自身催化切割位点。该方法包括酶原前体在大肠杆菌中以内含体的形式表达及随后在一定条件下的纯化和复性，在该条件下酶原前体的蛋白酶部分以其天然构形形成且然后经复性的酶原前体的切割是自身催化进行的。该方法的缺点是在复性和工业生产所必需的大容积中经常会发生高损失。胰蛋白酶类似物在巴斯德毕氏酵母中的重组生产描述于WO00/17332中。用于转化使用一种载体，其为一种胰蛋白酶原类似物(牛胰蛋白酶原的衍生物)编码，其中前肽C-末端的氨基酸赖氨酸通过突变交换为另一种氨基酸(除精氨酸或赖氨酸之外的)且其N-末端与功能信号肽融合。其中胰蛋白酶类似物以可溶的形式分泌到培养基中，且作为插入的突变结果即便在催化过程的相对高的pH值下不被不想要的自身催化作用活化和进一步降解。然后将氨肽酶用于活化。然而，该方法的缺点是需要去除额外的氨肽酶，该氨肽酶可以对于胰蛋白酶在最终过程中的进一步使用有不利的副作用。天然存在的胰蛋白酶原基因在巴斯德毕氏酵母中的表达描述于WO 01/55429中。为了避免自身催化活化，例如催化是在约为6的微酸性pH范围中进行的。因而在最适pH范围之外防止了在表达阶段较长的运行期中自身催化性活化。该方法其他的缺点是胰蛋白酶原基因对于在巴斯德毕氏酵母中的表达不是密码子最适化的及相关的低表达产率。本专利技术的目的是提供一种重组生产胰蛋白酶的方法，其中至少部分地消除了现有技术的缺点本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组生产胰蛋白酶的方法，该方法包含步骤：　　　　ａ）用重组核酸转化宿主细胞，该核酸编码一种由宿主可分泌的形式的前肽序列中具有肠激酶识别位点的胰蛋白酶原，　　　　ｂ）在一定条件下培养宿主细胞，该条件使得重组核酸能够表达且表达产物能够分泌到培养基中，该条件是为了基本防止前肽序列的自身催化性切割而选择的，　　　　ｃ）从培养基中分离表达产物，　　　　ｄ）切割前肽序列以形成活性胰蛋白酶且　　　　ｅ）从活性胰蛋白酶中可选择地分离未切割的胰蛋白酶原分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：R米勒，S格莱泽，F盖佩尔，JP塔尔霍费尔，B雷克塞尔，C施奈德，M拉特卡，S伦宁，H埃克施泰因，C吉塞尔，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]