稳定的蛋白酶组合物制造技术

提供一种组合物，其包含丝氨酸蛋白酶；所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂；和具有式Ⅰ的稳定剂Ｍ：也提供该组合物作为药物的应用，和其他应用，以及使用其各种性质的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定的蛋白酶组合物专利
本专利技术涉及一种酶组合物，其中通过在本专利技术的组合物中的一些 添加物稳定该酶。更具体地，本专利技术涉及一种丝氨酸蛋白酶组合物,包含丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂和如下定义的附加的稳定剂M。技术背景丝氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶，其特征在于在它们的活性位点 上具有丝氨酸和组氨酸残基。很多众所周知的酶都属于此类，例如胰 蛋白酶、激肽释放酶、凝血酶和纤溶酶。已经发现它们中的一些的实 际应用。胰蛋白酶用于皮革工业。凝血酶用作止血剂以阻止伤口出血。 另外两种丝氨酸蛋白酶一尿激酶和组织纤维蛋白溶酶原激活剂在临床 上用作血栓溶解剂，用于治疗急性心肌梗塞。很多这样的酶已经广泛 地用作研究工具，例如在蛋白质结构确定中。此外，这些酶可以在很 多诊断试剂盒中使用。对于大多数的丝氨酸蛋白酶，它们在溶液中的稳定非常有限，这 主要是由于当保留在溶液中时它们由于蛋白酶的性质会发生自降解。 当必须要把材料贮存在溶液中时，有限的稳定就是一个问题。现在可 用的商业丝氨酸蛋白酶制剂主要都是冷冻溶液或冻干粉末，它们具有 显而易见的缺点。溶解粉末或将冷冻溶液融化至适当的温度所需的额 外时间是最重要的问题。但是，这些制剂还有其他的问题。对于冷冻 溶液，在制造和运输到贮存的所有步骤中都需要控制温度(-2(TC)。对 于冻干粉末，需要重新生成的溶液具有可接受级别的纯度和稳定。同 时，该材料通常需要在非可控(例如严酷天气或缺少清洁水供应)的环 境中无菌制备(通过将这两部分混合)，需要检验粉末是否已经适当混 合。这些都是当前可用的产品的主要缺点，另外它们使用复杂并且成本较高。对于优选在阻止出血中必须立即使用的凝血酶，稳定问题迫使生 产商必须使用冻干的凝血酶或深度冷冻的溶液。然后，需要一定的时 间制备才能进行使用。两种血栓溶解剂一尿激酶和组织纤维蛋白溶酶 原激活剂都是以冻干制剂的形式出售，它们必须在使用前溶解。由于 必须在梗塞开始后尽可能早地开始急性心肌梗塞的血栓溶解治疗，这 些制剂产生的任何时间延迟都会成为问题。已经做出很多的努力来发现稳定各种丝氨酸蛋白酶的方法。对于 会相当快地自降解的胰蛋白酶， 一种简单和有效的稳定剂是钙离子(Sipos T和Merkel J， Biochemistry 9: 2766 (1970))。将pH降低 到4以下也是处理一些酶例如胰蛋白酶和纤溶酶的方法，但不适用于 凝血酶，这是因为它在pH小于5时会不可逆地失活。可以使用可逆的 蛋白酶抑制剂，但是并不通行，因为当使用它们本身时，它们会以有 害的方式干扰酶的作用(见下文)。为了稳定组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)， 一般使用的方法是加 入氨基酸一精氨酸。现在临床使用的tPA材料包含精氨酸作为稳定剂。同时，做了很多努力来发现稳定凝血酶溶液的方法。作为稳定添 加物的例子，建议了下列的材料高浓度的羧酸、EDTA、各种氨基酸、 白蛋白、聚合物例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇、甘油、 各种无机盐、糖类、明胶、胶原。日本专利申请JP2004191367描迷了包含试验试剂的稳定的凝血 酶，用于试验血凝结能力。该试验试剂包含凝血酶和凝血酶抑制剂， 也可以包含一种或多种稳定凝血酶的化合物，选自钓离子、有机酸、 表面活性剂和蛋白质。W0 02/100830、 W0 02/22575、 W0 00/20394、 W0 99/11658、 W0 02/37937和US 5, 409, 927都描述了不同的丝氨酸蛋白酶抑制剂化合 物及它们在制备治疗各种疾病情况，例如血栓形成中的应用，其中指 出了抑制相应的丝氨酸蛋白酶。Nakamura等人(/. C力層.A 1009, (2003)， 133-139)描述了固定的蛋白酶抑制剂在胰蛋白酶 - 样蛋白酶的亲和色语中的应用。Turner等人Cff/oc/ e/z//"/r， 25, (1986)， 4929-4935)描述了三 种对-脒基苯基酯，它们不可逆地抑制人的因子IXa。Tsung Fu Yang 等人("/謹cr婦/ecw/es , 25 ， (2004), 1926-1932)描述了阳离子型聚合物N， N-二乙基乙二胺聚氨酯的合成， 该聚合物可以用于基因递送。US专利申请2001/0033837 (对应于EP 1 136 084 Al)描述了一种 凝血酶制剂，包含非共价结合的抑制剂作为稳定剂。此外，该抑制剂 与其他稳定添加物例如糖或羧酸组合，以前在专利和其他出版物中已 经描述了这些稳定添加物。JP 200030025Q描述了凝血酶溶液的稳定，包括在不同的緩冲溶 液中加入聚乙烯醇、明胶或聚乙烯吡咯烷酮。在GB 1354761中，通过很多的材料，例如脂肪醇、羧酸、包含幾 基的杂环化合物和脂肪或脂环胺可以不同程度地稳定蛋白酶和淀粉酶o这样，已经描述了使用抑制剂来稳定丝氨酸蛋白酶(例如US 2001/0033837和JP 2004191367, J:义)。该方法的问题在于，如果在 使用该制品前不除去，那么抑制剂就会强烈地减弱酶的效果。如果使 用有效的抑制剂，大多数的酶活性都会丧失。 一种较好的方法是使用 中等强度的可逆抑制剂。但是，甚至在该情况下，相当部分的酶起始 活性仍然会丧失，因为需要提高抑制剂的浓度以得到良好的稳定效果。
技术实现思路
因此本专利技术的一个目的是完成一种丝氨酸蛋白酶组合物，它在溶 液中是稳定的，并且保持酶活性至足以实际使用该组合物的程度。本专利技术的另一个目的是提供一种丝氨酸蛋白酶组合物，它能够直 接使用而不需要由深度冷冻或冻干材料制备的前步骤。本专利技术的一个进一步的目的是通过提供其他的稳定组分使得丝氨 酸蛋白酶的可逆抑制剂就稳定目的而言的实际使用成为可能。通过所要求保护的本专利技术的不同方面可以实现本文中显而易见的 这些和其他目的。因此，本专利技术的一个方面提供一种稳定的丝氨酸蛋白酶组合物，包含a)丝氨酸蛋白酶；b)所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂；和c)具 有式I的稳定剂M:<formula>formula see original document page 12</formula>选自H ， -CH广R6 ， -CH广O-R6 ， -CH厂S-R6 ， -C0-NH-R6， -CH广NH-C0-R6, -CH2-0-CO-R6 ， -CH2-NH-C0-0R6， -CH2-NH-CS-NHR6 和其中n是0， 1或2;X是0， N或CH2;R1-114相同或不同 -CH广NH-R6， -CO-O-R6， -CH广NH-CO-NHR6 , -CH2-0-CO-NHR6;R5是RLR4或P-Q;P选自-(CH2)f和-(CH上-Y-(CH2)m-，其中m是l-6且Y是0， NH或S;Q选自H， -S03， -COOH， -NH2, —OH和-CONHs;R6各自独立地选自H，取代或未取代的低级烷基，取代或未取代 的环烷基，取代或未取代的苯曱基，取代或未取代的芳基或单-， 二-，或三环的具有一个或多个杂原子的未取代或取代的杂芳环和非芳 香杂环，所述取代的基团的取代基选自低级烷基、闺素、取代或未取 代的芳基、取代或未取代的杂-芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷 氨基；或其药学可接受的盐。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
稳定的丝氨酸蛋白酶组合物，包含ａ）丝氨酸蛋白酶；ｂ）所述丝氨酸蛋白酶的可逆抑制剂；和ｃ）具有式Ⅰ的稳定剂Ｍ：＊＊＊（Ⅰ）其中ｎ是０、１或２；Ｘ是Ｏ、Ｎ或ＣＨ↓［２］；Ｒ↑［１］－Ｒ↑［４］相同或不 同、选自Ｈ、－ＣＨ↓［２］－Ｒ↑［６］、－ＣＨ↓［２］－Ｏ－Ｒ↑［６］、－ＣＨ↓［２］－Ｓ－Ｒ↑［６］、－ＣＨ↓［２］－ＮＨ－Ｒ↑［６］、－ＣＯ－Ｏ－Ｒ↑［６］、－ＣＯ－ＮＨ－Ｒ↑［６］、－ＣＨ↓［２］－ＮＨ－ＣＯ－Ｒ↑［６］、－ＣＨ↓［２］－Ｏ－ＣＯ－Ｒ↑［６］、－ＣＨ↓［２］－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨＲ↑［６］、－ＣＨ↓［２］－ＮＨ－ＣＯ－ＯＲ↑［６］、－ＣＨ↓［２］－ＮＨ－ＣＳ－ＮＨＲ↑［６］和－ＣＨ↓［２］－Ｏ－ＣＯ－ＮＨＲ↑［６］；Ｒ↑［５］是Ｒ↑［１］－Ｒ↑［４］ 或Ｐ－Ｑ；Ｐ选自－（ＣＨ↓［２］）↓［ｍ］－和－（ＣＨ↓［２］）↓［ｍ］－Ｙ－（ＣＨ↓［２］）↓［ｍ］－、其中ｍ是１－６且Ｙ是Ｏ、ＮＨ或Ｓ；Ｑ选自Ｈ、－ＳＯ↓［３］、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ↓［２］、－ＯＨ和－ＣＯＮＨ↓［２］；　 　Ｒ↑［６］各自独立地选自Ｈ、取代或未取代的低级烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的苯甲基、取代或未取代的芳基或单－、二－、或三环的具有一个或多个杂原子的未取代或取代的杂芳环和非芳香杂环，所述取代的基团的取代基选自低级烷基、卤素、 取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂－芳香化合物、非芳香杂环、烷氧基、烷氨基；或其药学可接受的盐。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：LO安德松，H阿格兰，
申请(专利权)人：特罗比奥股份公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]