本发明专利技术提供了一种基于量子点共振能量转移的MGMT活性检测试剂盒及方法。所述试剂盒主要包括：（1）链霉亲和素修饰的磁性量子点；（2）四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物；（3）生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤；（4）缓冲液A；（5）O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品。本发明专利技术利用量子点与罗丹明之间的共振能量转移原理进行MGMT的活性检测，以最大限度地避免对TMR的直接激发，降低假阳性的发生率；使用Biotin-BG和anti-MGMT两种特异探针，通过酶催化和抗原-抗体的双重特异反应，保证了反应结果具有高度的特异性；本发明专利技术使用磁分离技术，简化了分离步骤，达到快速检测的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于量子点共振能量转移的MGMT活性检测试剂盒及方法。
技术介绍
烷化剂是最大一类抗肿瘤药物，临床上常用的例子有环磷酰胺、尼莫司汀、卡巴嗪、硝卡芥、氮芥和替莫唑胺等，广泛用于治疗脑、头颈、肝、食管、肺、泌尿、生殖、血液等恶性肿瘤。烷化剂药物对肿瘤细胞的杀伤主要是通过对DNA分子的鸟嘌呤O6位上的烷基化而实现的，而 O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶(O6-Methylguanine DNA-Methyltransferase, MGMT)的存在能够去除这种烷基加合物，使肿瘤细胞和正常细胞得以生存而产生所谓的耐药性，是哺乳动物细胞修复烷化剂所造成DNA损伤的一个重要环节。如果肿瘤细胞中的 MGMT水平过高可能会导致耐药，而对于正常细胞却可能减少其化疗的毒副作用。如何控制 MGMT水平以达到最佳的化疗效果是如今MGMT研究的热点。而且，MGMT在预测肿瘤化疗的效果以及制订个体化治疗方案的潜在价值也已被大量实例研究所证实并被医学界广泛认可。因此，如何灵敏、准确地检测MGMT在细胞中的活性，对提高化疗效果以及减少药物毒副作用有着重要的意义。不幸的是，目前还没有一种简易可靠、可应用于常规临床检验的方法来测定具有重要肿瘤学价值的MGMT活性。已有大量文献描述MGMT基因启动子甲基化以及MGMT蛋白表达的免疫测定并试图建立这些分子生物学和血清学指标与肿瘤耐药性、生存率以及个体化治疗方案的相关性，但这些烦琐而且不稳定的检测方法不适合在临床上常规使用，也因为它们不直接测定MGMT的酶学活性而可能引入各种与肿瘤耐药机制无关的干扰因素。基于同位素标记底物的MGMT活性测定法只适用于实验室研究而难以被用于常规临床检验中； 此外，这种方法所用的蛋白沉淀步骤容易引入诸如黑色素(Melanin)等蛋白的非特异结合， 引起假阳性。虽然有人用非同位素标记的底物和酶联免疫分析方法来测定MGMT活性，但这个方法需要多步而费时的固相分离和反应。从临床应用和检测效率(灵敏度)的角度来看， 这是个明显的缺点。很明显，无论在肿瘤生物学的基础研究中还是在肿瘤治疗的临床实践中，都急需发展一种简单可靠的方法来特异、灵敏地测定各种肿瘤组织和血样中的MGMT活性。能量转移现象，即为内源性发色基团发生荧光淬灭和外源发色基团发生荧光敏化的现象。当两种物质分子的吸收峰和发射峰重叠或部分重叠时，通过分子之间的偶极一偶极的共振偶合可以使能量从供给体转移至受体。其中吸收能量的基团或物质成为能量受体，反之为能量供体。而突光共振能量转移(Fluorescence energy transfer, FRET)是指电子激发能在适当的能量给体和受体之间传递，通过能量接受体的荧光增强可以简单地对待测物质进行定量分析，但是目前分析中所用的有机荧光染料存在吸收光谱窄、发射光拖尾等诸多问题，从而影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，并且供、受体发射光谱易产生相互干扰。最近报道的将发光量子点用于共振能量转移，可克服有机染料的不足之处，相对传统的有机荧光染料分子，量子点的发射光谱窄并且不拖尾，并有较宽的光谱激发范围，将它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，以最大限度地避免对能量受体的直接激发。因此，将荧光量子点用于MGMT的活性检测，可降低假阳性的发生率，并且具有较高的灵敏度，可以检测同等反应下相对常规浓度较低的被测物。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种基于FRET的MGMT活性检测的新方法，克服现有方法的不足。本专利技术采用的技术方案是基于量子点共振能量转移的MGMT活性检测试剂盒，主要包括( I)链霉未和素修饰的磁性量子点；(2 )四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物；(3)生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤；(4)缓冲液A，其终浓度组成如下20mM DTT, 2mM EDTA, 20%(v/v)丙三醇，溶剂为 IOOmM Tris-HCl, pH 7. 6 ；(5) O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶标准品。本专利技术试剂盒原理如下(I)待测MGMT样品(a)与其底物即生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤(b)反应， 在苄基转移到酶蛋白后形成生物素标记的MGMT (c) ;(2)加入表面修饰链霉亲和素的磁性量子点(Mag-QDs-SA) Cd)以及荧光染料四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物 (tetramethylrhodamine-labeled anti-MGMT,TMR-anti-MGMT) (e)分别与 MGMT 结合，结果以MGMT为桥梁把量子点和罗丹明拉近到有效距离内；(3)在外界激发光激发下，量子点发光以及到罗丹明的共振能量转移。无MGMT活性的样本在检测中无法与生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤反应，进而无法使Mag-QDs-SA和TMR_anti_MGMT通过MGMT的桥联作用结合在一起，QDs与TMR之间无法发生荧光能量转移，也就不能检测到TMR的荧光发射峰增强。因此可以通过测量能量转移下罗丹明发射光的增强程度就可以得到与MGMT活性相关的定量指标，由此建立MGMT活性和能量转移关系的标准曲线并应用到各种检测场合。其原理图如图 I所示。本专利技术还涉及一种利用所述试剂盒检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的方法，所述方法包括(I)提取待测样品的总蛋白质；(2)取10 μ L上述提取的总蛋白质，溶于50 μ L的缓冲液A中，然后加入50pmol 的生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤，用纯水补足至300 μ L，经震荡混匀后，室温下反应90min， 然后加入50pmol链霉亲和素修饰的磁性量子点，用缓冲液A补足至300 μ L，充分振荡混匀反应5min后，然后在磁力作用下，除去上清液，用缓冲液A反复洗涤多次，加入50pmol四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物，用含1%BSA的缓冲液A补足至300 μ L，充分振荡混匀反应30min，在磁力作用下除去上清液，并用缓冲液A反复洗涤多次，最后加入缓冲液A 300 μ L，移至96孔板中，在Wallac 1420酶标仪上测定其在400nm的激发光下、在585nm处的发射光强；(3)取不同量的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶溶于50 μ L缓冲液A中，配制梯度浓度的标准品溶液，分别按照步骤(2)的方法，进行反应，最后在Wallac 1420酶标仪上测定其在400nm的激发光下、在585nm处的发射光强，绘制TMR荧光增强程度-MGMT浓度标准曲线；TMR荧光增强强度可通过下式计算得到TMR荧光增强程度(％)= (FRET后TMR荧光强度一FRET前TMR荧光强度)/FRET前 TMR荧光强度FRET后TMR荧光强度即加入样品或标准品后反应溶液在400nm的激发光下、在 585nm处测得 的发射光强度，FRET前TMR荧光强度即MGMT浓度为O (即未添加样品或标准品)时反应溶液在585nm处的荧光发射强度；(4)根据样品测得的荧光强度值，对照标准曲线，获得样品中的MGMT浓度数据。所述待测样品为临床组织样品或临床细胞株样品。待测样品为肿瘤细胞株样品时，总蛋白提取步骤如下I.裂解液制备每500uL冷的缓冲液A (20mM DTT,2mM EDTA, 20% (v/v)丙三醇， 溶剂为IOOmM Tris-HCl本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于量子点共振能量转移的MGMT活性检测试剂盒，主要包括：（1）链霉亲和素修饰的磁性量子点；（2）四甲基罗丹明标记的抗MGMT抗体耦合物；（3）生物素标记的O6?苄基鸟嘌呤；（4）缓冲液A，其终浓度组成如下：20mM?DTT，2mM?EDTA，20%丙三醇，溶剂为100mM?Tris?HCl，pH?7.6；（5）O6?甲基鸟嘌呤?DNA甲基转移酶标准品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁媛媛，陈灿玉，焦艳华，张现侠，郭卫强，章鹏飞，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：
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