一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，用纯化的人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，再与Alexa Fluor488标记的以及Alexa Fluor594标记的GFAP抗体结合，形成抗体‑抗原‑两个荧光标抗体复合物，利用FRET原理用荧光酶标仪测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)浓度。由于用到了三个抗体同时识别，特异性更高，准确性更好，并比现有方法检测时间大大缩短。为临床诊断提供了参考信息，有助于临床医生诊断和评估脑卒中进展情况，改善病人的预后。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于荧光能量共振转移法（FRET）的GFAP检测方法。
技术介绍
流行病学调查研究表明，目前脑血管疾病与心脏病、恶性肿瘤构成人类疾病死亡的三大原因。与西方发达国家相比，我国脑血管病的发病率和死亡率明显高于心血管病。据估算，全国每年新发脑卒中患者约为200万人；每年死于脑卒中的患者约150万人；存活患者人数600万～700万；且70％～80％的存活者遗留瘫痪、失语等严重残疾，给社会和家庭带来沉重负担。其中，脑出血是一种致死率和致残率均高的常见病、多发病，严重危害人类特别是老年人的健康，威胁病人的生命，严重影响病人生活质量。胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)是一种分子量为50～52KDa的酸性蛋白，属细胞骨骼蛋白，是星形细胞胞质内的特异性蛋白，标志蛋白。GFAP在星形胶质细胞受到刺激引起反应时，其表达发生变化，在星形细胞中有丰富的、唯一的表达。研究发现GFAP和痴呆、多发性硬化及脑卒中有明显相关性。脑出血后神经元和神经胶质细胞受到损害，大量的胞浆蛋白质漏出细胞进入细胞间液，可溶性的GFAP通过细胞间液进入脑脊液，穿过破坏的血脑屏障进入血液循环。有研究表明脑出血患者发病6小时内血清GFAP水平即明显升高，而缺血性脑卒中患者6小时内血清GFAP水平与正常对照组无明显差异，因此认为GFAP是急性脑出血的生物学标志物。此外，还有研究表明，急性脑出血患者血清中的GFAP与脑出血体积之间有着密切的正相关关系，因此可以通过脑出血患者血清GFAP水平来判断患者的病情和预后。目前，临床诊断上对GFAP的检测主要是ELISA实验方法，该方法因其特异性、灵敏度高而在近二十年来被广泛应用，但该方法步骤繁琐，所需检验时间较长。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，该方法特异性高，准确性好，检测用时短，操作方便。本专利技术是通过以下技术方案来实现：本专利技术公开的一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，包括以下步骤：1）采集待检测全血样品的血清；2）用纯化的神经胶质纤维酸性蛋白抗体包被微孔板，制成固相抗体；3）向包被抗体的微孔中加入神经胶质纤维酸性蛋白，然后再与AlexaFluor488以及AlexaFluor594标记的神经胶质纤维酸性蛋白抗体结合，形成抗体-抗原-两个荧光标记抗体复合物；4）利用荧光能量共振转移法，用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线计算出待检测全血样品中神经胶质纤维酸性蛋白浓度。步骤1）中，采集血清具体操作为：将全血样品于室温下放置2h或4℃过夜后，于1000×g离心20min，取上清既得到血清。步骤2）中，是将抗神经胶质纤维酸性蛋白抗体按1:200倍进行稀释，然后每孔加入100μl，于4℃过夜包被，制得固相抗体。步骤3）中，每孔加入1:200倍稀释的AlexaFluor488以及AlexaFluor594标记的神经胶质纤维酸性蛋白抗体100μl，加上覆膜，于37℃温育30min。步骤4）中，是在激发波长为409nm，发射波长为617nm的条件下测定吸光度。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：本专利技术公开的基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，用纯化的人神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP），再与AlexaFluor488标记的以及AlexaFluor594标记的GFAP抗体结合，形成抗体-抗原-两个荧光标抗体复合物，利用FRET原理用荧光酶标仪（在490/617nm波长下）测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）浓度。由于用到了三个抗体同时识别，特异性更高，准确性更好，并比现有方法检测时间大大缩短。为临床诊断提供了参考信息，有助于临床医生诊断和评估脑卒中进展情况，改善病人的预后。附图说明图1为用R&D公司HumanGFAPElisa检测试剂盒所作标曲；图2为用R&D公司HumanGFAPElisa检测正常对照以及stroke病人血清结果；图3为用本专利技术所述方法所作标曲；图4为用本专利技术所述方法检测正常对照以及stroke病人血清结果。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。本专利技术的公开的基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，需要三个抗体同时识别，具有比Elisa更高的特异性，避免了Elisa法的一些假阳性。同时利用两个荧光标价抗体间FRET直接检测，省去了Elisa中多部清洗，底物显色的步骤，大大缩短检测时间。本专利技术公开的基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，包括以下操作：1、收集血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测；收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。2、酶标板包被：将抗GFAP抗体按1:200稀释，每孔加入100μl，4℃过夜包被。3、弃去孔内液体，甩干，用washbuffer（PBST）洗板3次，大约300μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。4、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；空白孔加标准品和样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。给酶标板覆膜，37℃孵育40分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。5、弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约30μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。6、每孔加1:200稀释的荧光（AlexaFluor488及AlexaFluor594）标记的GFAP抗体100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。7、弃去孔内液体，甩干，洗板2次，每孔加入100μLPBS。8、立即用酶标仪在490/617nm波长下测定吸光度（OD值）。实验结果参见附图，图1和图2是用国际知名品牌R&D公司的GFAP检测试剂盒检测的5个stroke病人血清结果，图3和图4是用本专利技术方法检测同样的血清，得出的结果。从结果上看，本专利技术方法与R&D试剂盒检测结果基本一致。但R&D的一次检测，操作时间大约在8h左右，而本专利技术方法除去酶标板包被时间（因为不需要每次都包被，可以一次包被多块，储存备用），可以在2h之内完成检测。另外，结合几位病人最终临床诊断结果，发现本专利技术三个抗体同时识别，特异性更高，准确性更好。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采集待检测全血样品的血清；2)用纯化的神经胶质纤维酸性蛋白抗体包被微孔板，制成固相抗体；3)向包被抗体的微孔中加入神经胶质纤维酸性蛋白，然后再与Alexa Fluor488以及Alexa Fluor594标记的神经胶质纤维酸性蛋白抗体结合，形成抗体‑抗原‑两个荧光标记抗体复合物；4)利用荧光能量共振转移法，用酶标仪测定抗体‑抗原‑两个荧光标记抗体复合物的吸光度，然后通过标准曲线计算出待检测全血样品中GFAP的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)采集待检测全血样品的血清；2)用纯化的神经胶质纤维酸性蛋白抗体包被微孔板，制成固相抗体；3)向包被抗体的微孔中加入神经胶质纤维酸性蛋白，然后再与AlexaFluor488以及AlexaFluor594标记的神经胶质纤维酸性蛋白抗体结合，形成抗体-抗原-两个荧光标记抗体复合物；4)利用荧光能量共振转移法，用酶标仪测定抗体-抗原-两个荧光标记抗体复合物的吸光度，然后通过标准曲线计算出待检测全血样品中GFAP的浓度。2.根据权利要求1所述的基于荧光能量共振转移法的GFAP检测方法，其特征在于，步骤1)中，采集血清具体操作为：将全血样品于室温下放置2h或4℃过夜后，于...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫亚平，秦李娜，李科，
申请(专利权)人：陕西脉元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61