本发明专利技术提供一种基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器的接头以及包含该接头的单分子型FRET生物传感器等，其能够非侵袭性地测定丝氨酸－苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性和低分子量GTP结合蛋白活性等。一种接头，其为包括52个氨基酸残基以上、400个氨基酸残基以下的多肽，总氨基酸残基数的至少95%由甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸构成，甘氨酸为35～65%，丝氨酸和苏氨酸的至少任一个为10～40%，丙氨酸为10～40%；包含该接头的单分子型FRET生物传感器；保持包含编码该生物传感器的基因的表达载体的转化细胞和转基因非人动物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于将基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器最适化的接头(linker)、包括该接头的生物传感器、编码该接头或单分子型FRET生物传感器的基因、包含该接头或单分子型FRET生物传感器的表达载体、具有该表达载体的转化细胞和转基因非人动物、使用上述生物传感器的测定方法。
技术介绍
在生命科学领域中，利用突光共振能量转移(Fluorescene resonance energytransfer,以下称为FRET)的原理和荧光蛋白的生物传感器正在快速地扩展(例如参照非专利文献I 4)。FRET是指从处于激发状态的荧光分子(供体:能量供给体)向非常近的荧光分子(受体:能量接受体)转移激发能量的现象。利用FRET的生物传感器的普及大大促进绿色荧光蛋白(GFP)的颜色突变体的出现及其改良。现在，很多情况下，作为GFP突变体的CFP(青色荧光蛋白)和YFP (黄色荧光蛋白)作为供体和受体荧光蛋白而被利用。使用荧光蛋白的FRET生物传感器系统分为双分子型FRET生物传感器(图1)和单分子型FRET生物传感器(图2)。双分子型FRET生物传感器检测分子间相互作用，单分子型FRET生物传感器检测分子的结构变化(例如，参照非专利文献I 4)。其中，单分子型生物传感器(单分子型FRET生物传感器)开发了离子、糖、脂质等低分子的定量、低分子量GTP结合蛋白、激酶等的活性测定中使用的传感器(例如，参照非专利文献4)。 但是，为了制作该生物传感器，需要结合至少3个，很多情况下4个以上的蛋白质结构域，仅仅将它们简单接合，通常无法制作具有充分的灵敏度的单分子型FRET生物传感器。即，为了制作这样的单分子型FRET生物传感器，必须考虑以下3个因子:i)受体荧光蛋白的发光光谱与受体荧光蛋白的吸光光谱的重叠；ii)受体荧光蛋白与受体荧光蛋白之间的距离；iii)受体荧光蛋白的发光瞬间和受体荧光蛋白的吸光瞬间的取向。此外，在荧光蛋白与其他蛋白质融合的情况下，与其他蛋白质融合成为负荷，从而产生荧光蛋白的错误折叠，其结果，发色团形成的效率降低，还必须考虑到有可能成为无荧光。这样，利用受体荧光蛋白和受体荧光蛋白在两者之间产生FRET的良好的表达存在严格的条件，两者间的配置等也没有发现一定的规则，因此，每个制作的单分子型FRET生物传感器都需要将各种蛋白质结构域的长度、结构域之间的接头序列等进行各种各样的变更，制作最适宜的传感器，但是这需要多次试行错误或复杂高度的试验等，具有充分灵敏度的单分子型FRET生物传感器的开发非常的困难。作为连接各结构域的接头，报告有9个氨基酸的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸构成的接头(例如参照非专利文献5)、72个氨基酸的甘氨酸接头(例如参照非专利文献6)，但是不能够说充分最适化。此外，这些接头中，没有在多种单分子型FRET生物传感器中共通的最适化的接头。现有技术文献非专利文献非专利文献1:Aoki, K.and M.Matsuda.2009.Visualization of small GTPaseactivity with fluorescence resonance energy transfer-based biosensors.NatureProtocol4:1623-1631非专利文献2:Giepmans, B.N., S.R.Adams, M.H.Ellisman, and R.Y.Tsien.2006.The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.Science312:217-224非专利文献3:Jares-Erijman, E.A.and T.M.Jovin.1maging molecularinteractions in living cells by FRET microscopy.2006.Curr.0pin.Chem.Biol.10:409-416.非专利文献4:Kiyokawa, E.，S.Hara, T.Nakamura, and M.Matsuda.2006.Fluorescence (Forster)resonance energy transfer imaging of oncogene activity inliving cells.Cancer Sc1.97:8-15.非专利文献5:1toh, R.E., K.Kurokawa, Y.0hba, H.Yoshizaki, N.Mochizuki,and M.Matsuda.2002.Activation of Rac and Cdc42video-1maged byFRET—based single-molecule probes in the membrane of living cells.Mol.Cell.Biol.22:6582-6591.非专利文献6:Harvey, C.D., A.G.Ehrhardt, C.Cellurale.H.Zhong, R.Yasuda, R.J.Davis, and K.Svoboda.2008.A genetically encoded fluorescent sensor of ERKactivity.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A
技术实现思路
·专利技术要解决的课题本专利技术就是为了解决上述现有的问题，以达成以下的目的为课题的。即，本专利技术的目的在于提供一种用于将基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器最适化，得到高灵敏度的单分子型FRET生物传感器而能够广泛使用的接头(以下，本说明书中，本专利技术的接头称为EV (Enhanced visualization)接头)、包含该接头的生物传感器、编码该接头或生物传感器的基因、包含该接头或生物传感器的表达载体、具有该表达载体的转化细胞和转基因非人动物、和使用包含上述接头的生物传感器的测定丝氨酸-苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性、低分子量GTP结合蛋白的活性而使用适宜的上述单分子型FRET生物传感器的测定方法。用于解决课题的方法为了解决上述课题进行了潜心研究，发现具有一定以上长度的接头可以解决上述问题，该接头将基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器最适化，为了获得高灵敏度的单分子型FRET生物传感器而能够广泛应用。并且发现，通过包含一定比例或一定序列的特定氨基酸的重复，能够提高最适化的效果。S卩，本专利技术基于下述见解:使用具有一定以上长度的接头，能够显著降低作为降低单分子型FRET生物传感器的增益的主要原因的基础状态的FRET，本专利技术能够广泛应用在单分子型FRET生物传感器制作中。本专利技术的接头是为了增大上述单分子型FRET生物传感器的增益而开发得到的接头，其技术价值非常大。 g卩，用于解决上述课题的方法如下。(I) 一种接头，其为基于荧光共振能量转移原理的单分子型FRET生物传感器的接头，所述接头的特征在于，其为包括52个氨基酸残基以上、400个氨基酸残基以下的多肽，总氨基酸残基数的至少45%为甘氨酸和丙氨酸的至少任一个，丙氨酸在总氨基酸残基数中含有至少10%。(2)如上述(I)所述的接头，其为包括84个氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：松田道行，小松直贵，青木一洋，上冈裕治，幸长弘子，稻冈芳惠，樱井敦朗，清川悦子，隅山健太，
申请(专利权)人：国立大学法人京都大学，
类型：
国别省市：
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