方法技术

本发明专利技术涉及修饰包含至少两个赖氨酸残基的多肽中特定的赖氨酸残基的方法，所述方法包括：(a)提供包含受第一保护基团保护的目标赖氨酸和至少一个另外的赖氨酸残基的多肽；(b)处理所述多肽以保护所述另外的赖氨酸残基，其中，所述另外的赖氨酸残基的保护基团与目标赖氨酸残基的保护基团不同；(c)选择性地去保护目标赖氨酸残基；和(d)修饰(c)中去保护了的赖氨酸残基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】技 术领域本专利技术涉及蛋白质的合成和修饰。具体地，本专利技术涉及赖氨酸连接的蛋白质的修饰。
技术介绍
赖氨酸残基是蛋白质翻译后修饰的关键决定因素，它们在主要的翻译后修饰如泛素化、甲基化和乙酰化中的作用已为人熟知。然而，选择性地修饰蛋白质中的特定赖氨酸残基仍是一个问题。泛素化是一个可逆的翻译后修饰，在该过程中受体蛋白中的特定赖氨酸残基与泛素供体的C-末端形成异肽键。虽然泛素化通过蛋白酶体靶向来调节蛋白质稳定性的作用是公认的，但目前显示泛素参与生物学的几乎每一个方面，包括细胞信号转导、细胞内转运和对DNA损伤的应答W。泛素通过它的每个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48或K63)或通过N-末端形成共价链，并且认为泛素在不同的生物过程中介导的不同功能可能被编码在不同泛素链的不同性质中2’3。虽然蛋白质组学研究揭示体内存在所有的链类型4’5，但所知的多数均与K48链和K63链有关，这两个链分别在蛋白酶体降解和细胞信号传导中起重要作用w。相比之下，对其他所谓的“非典型”连接(linkage)知之甚少，而这些“非典型”连接则占在蛋白质组学数据已知的模式生物中发现的泛素连接的一半以上5。研究具体泛素链的作用的关键难题在于合成具有所定义的连接的均质链。本专利技术旨在克服与现有技术相关的问题。专利技术概述本专利技术人已经解决了特异靶向多肽链内用于修饰的单个赖氨酸残基的问题，其中一方面是在基因工程上编码用于目标赖氨酸的化学保护。这能够实现多肽链内特定残基的位点特异性保护。更重要的是，本专利技术人开发了用于差异保护多肽中的赖氨酸的技术。具体而言，本专利技术人教导了不同于基因工程编码的保护的化学保护的使用。通过这种方式，产生的多肽可具有受通过目标赖氨酸的基因工程编码保护的位点特异性保护的所述目标赖氨酸。然后，这种具有受位点特异性保护的赖氨酸的多肽可以进行化学处理以保护每个剩余的(未被保护的)具有不同化学保护基团的赖氨酸残基。这种双重具有的优点是形成的多肽在其赖氨酸上具有两种不同类型的化学保护。这能够使原始的目标赖氨酸通过化学被选择性地去保护，同时使其他赖氨酸上的其他保护基团保持完整。通过这种方式，目标赖氨酸被位点特异地的去保护并因此可以被修饰，而其他赖氨酸则不受影响。最后，根据需要所有未被修饰的赖氨酸都可以被任选地去保护以留下与天然相同的赖氨酸残基。本专利技术是基于选择性的保护/去保护多肽序列中的目标赖氨酸的创造性的差异化学。因此，一方面，本专利技术提供了修饰包含至少两个赖氨酸残基的多肽中的特定赖氨酸残基的，所述包括(a)提供包含受第一保护基团保护的目标赖氨酸残基和至少一个另外的赖氨酸残基的多妝；(b)处理所述多肽以保护所述另外的赖氨酸残基，其中所述另外的赖氨酸残基的保护基团不同于所述目标赖氨酸残基的保护基团；(C)选择性地去保护目标赖氨酸残基；和 (d)修饰(C)的所述去保护了的赖氨酸残基。合适地，所述多肽的产生包括(i)提供编码所述多肽的核酸，所述核酸包含编码所述目标赖氨酸的正交密码子;(ii)在正交tRNA合成酶/tRNA对存在下翻译所述核酸，其中所述正交tRNA合成酶/tRNA对能够识别所述正交密码子并向所述多肽链中引入受第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基。合适地，所述正交密码子包括TAG，所述tRNA包括MbtRNAatt,所述tRNA合成酶包括 MbPyIRS。合适地，由第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基选自由N ε -(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸组成的组。合适地，由第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基是N ε_(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸。合适地，所述另外的赖氨酸残基的保护基团选自N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)。当所述另外的赖氨酸残基的保护基团是N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)时，合适地，它在碱性DMSO中提供。合适地，所述另外的赖氨酸残基的保护基团是N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)。合适地，步骤(b)包括用含N-(苄氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺(Cbz-Osu)的碱性DMSO处理所述多肽。合适地，所用的Cbz-Osu的量计算为乘以。有利地，这提供了用于与待保护的赖氨酸反应的略过量的保护基团，并由此有助于推动反应完全(饱和度/均匀性)。合适地，步骤(C)包括用含三氟乙酸(TFA)的水处理所述多肽。合适地，步骤(d)的修饰包括(i)通过在Ag (I)存在下转换成N-羟基琥珀酰亚胺酯而活化硫酯；(ii)将待连接的多肽加入至所述目标赖氨酸；和(iii)温育以形成特异的异肽键。合适地，步骤(d)的修饰在目标赖氨酸残基的ε -氨基基团上进行。合适地，在步骤(d)中可对目标赖氨酸进行多个修饰。合适地，如上所述的另外包括步骤(e):使所述另外的赖氨酸残基去保护。合适地，步骤(e)包括用比例为1:3:6的三氟甲磺酸(TFMSA):三氟乙酸(TFA) : 二甲基硫醚(DMS)的混合物处理所述多肽。修饰完成后去保护所有剩余的赖氨酸的好处之一是将所述多肽恢复至与其天然形式尽可能接近。合适地，步骤(a)包括通过在所述多肽的翻译过程中从基因工程学上向所述多肽链中引入受第一保护基团保护的所述目标赖氨酸残基而产生所述多肽。合适地，所述多肽是泛素。合适地，步骤(d)的修饰是另外的多肽链与所述目标赖氨酸的共价连接。合适地，所述另外的多肽链是泛素。在该实施方式中，本专利技术可有利地应用于多肽的泛素化。在一些实施方式中，所述多肽是泛素，所述另外的多肽链是泛素。在这些实施方式中，本专利技术可有利地应用于泛素链的生产。这些链可以简单地通过在第一多肽中选择适当·的赖氨酸残基进行靶向而以泛素的任何K-连接形式(如K6、K11、K27、K29、K33、K48或Κ63连接的泛素)产生。在进行多个修饰时，可重复步骤(c)-(d)以产生由通过赖氨酸残基的共价连接而连接的多肽链。显然，这可能包括在每轮修饰结束时且在按修饰顺序的下一反应进行前的重复去保护。或者，如果用于后续修饰的反应化学已经特异于来自前(几)轮修饰的目标赖氨酸(或经修饰的目标赖氨酸)，则后续的修饰可能不需要保护/去保护。本专利技术还提供了根据上述产生的多肽。所述多肽可包括K-连接的泛素链。所述K-连接可以是Κ6、Κ11、Κ27、Κ29、Κ33、Κ48或Κ63连接。合适地，所述K-连接是Κ6或Κ29连接。另一方面，本专利技术涉及TRABID作为Κ29去泛素化酶的应用。另一方面，本专利技术涉及切割Κ29连接的泛素的，所述包括使Κ29连接的泛素与TRABID接触。另一方面，本专利技术涉及包含至少一个受保护的赖氨酸残基的泛素多肽。泛素多肽包含一个或多个K6Boc、K29Boc。另一方面，本专利技术涉及编码泛素的核酸，其中在所述泛素中至少一个赖氨酸密码子被正交密码子替代。另一方面，本专利技术涉及本专利技术的K-连接泛素用于例如活化或增强对DNA损伤的响应，和/或用于预防或治疗诸如早发型乳腺癌或卵巢癌的癌症中的应用。这些应用可有利地用于药物中。本专利技术优选的也可在以下说明书中称为G0PAL(基因工程上编码的正交保护和活性连接)。合适地，本专利技术中的靶向反应用于将蛋白质连接在一起。在本专利技术的另一方面，提供了可从所述获得的蛋白质。合适地，所述蛋白质是泛素。在本专利技术的另一方面，提供了均匀连接的泛素链，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾森·钦，维·P·阮，萨特帕尔·维尔德，
申请(专利权)人：医药研究委员会，
类型：
国别省市：