混合脂肪酸的高效液相色谱分离方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种利用高效液相色谱分离脂肪酸混合物的方法及其应用。针对现有技术中缺少利用HPLC在同时分离亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸等6种脂肪酸混合物方法的不足，本发明专利技术提供一种利用HPLC同时分离亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸6种脂肪酸混合物的方法。该方法将待测脂肪酸溶液用ω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和三乙醇胺的丙酮溶液进行脂化处理，再进行HPLC分离。HPLC采用等度洗脱方式，流动相选用乙腈-水溶液，柱温10℃～20℃。与现有技术相比，本发明专利技术方法能够将棕榈油酸与棕榈酸同亚麻酸、亚油酸、油酸、硬脂酸分离，并且较宽的柱温条件能够有效保护色谱柱。方法分离效果好、检测灵敏度高、结果准确可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种脂肪酸混合物的分离方法，特别是涉及一种利用高效液相色谱分离脂肪酸混合物的方法及其应用。
技术介绍
脂肪酸是一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，是重要的工业原料，也是有机体主要营养素的重要成分和主要能量来源之一。随着人们生活水平的提高，对脂肪酸的测定愈来愈显得重要。食品营养及安全方面，各种食用油、粮食、水果以及奶粉的脂肪酸组成成分及含量的测定是必不可少的；医药方面，一些疾病患者疾病的诊断，中草药、注射液等的品质好坏均依赖于对脂肪酸组成及含量的分析；能源方面，越发重要的生物能源的评价及研究需要越来越成熟的高效，低成本，精确的脂肪酸测定方法；环境卫生方面，污水中过氧脂肪酸等的检测也是一项十分重要的指标。在科学研究领域，如生物膜结构、功能，动植·物及微生物的脂肪酸代谢等方面的研究，对脂肪酸进行原位水平研究的前提是对脂肪酸分离及含量测定甚至超微量分析。如何科学、精确地测定脂肪酸的组成及含量是诸多脂肪酸的研究、分析、生产等能够得到开展并得到可靠结果的基础。因此，如何高效、快速、精准地分析脂肪酸组成，并实现检测成本的最低化，是脂肪酸分离和定量的迫切要求。很长一段时间内人们一直采用气相色谱(GC)完成对脂肪酸的分离和含量测定，由于气相色谱的分离能力及灵敏度不如液相色谱高，使得该方法在混合脂肪酸样品及痕量分析中难以凑效。自上世纪90年代起有研究者开始尝试用液相色谱法分离不同的脂肪酸，但所能实现的分离效果不佳，能同时分离出的脂肪酸各类也很少。高效液相色谱(HPLC)法采用常规的紫外一可见光检测器，能够达到检测灵敏度明显提高的目的，并且检测结果达到ng级水平，因此在实际检测中的具有广阔的适用范围。在脂肪酸分析领域，由于HPLC定量准确度高、重现性好、分离能力强，在脂肪酸分离上的应用一直为研究者所重视，但研究成果却并不理想。表现为或者分离效果不佳，或者同时分离的脂肪酸种类很少。特别是在分离几种分子量和物化性质都很接近的脂肪酸混合物时，现有技术中更是鲜见报道。所以无论在实验室还是实际生产中，用HPLC分析脂肪酸的方法使用率并不高。亚麻酸(C18:3)、棕榈油酸(C16:l)、亚油酸(C18:2)、油酸(C18:l)、棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)是自然界中常见的6种脂肪酸，它们是生物膜组织和神经组织的重要组成成分。由于这6种脂肪酸通常是混合存在于生物组织中，因此对它们的分离与定量分析是诸多相关研究内容的基础。但这6种脂肪酸具有既相相近似又复杂的化学、物理性质，采用HPLC进行的相互分离方法一直收效甚微，特别是利用HPLC完成的对这6种混合脂肪酸的同时分离与定量分析的方法更为有限。HPLC是耗时较长的分离方法，在实践中，同时分离6种脂肪酸的方法相较于分批分离6种脂肪酸的方法能够极大节约分离时间、提高分离效率。《蚕蛹混合脂肪酸中a-亚麻酸的分离纯化》(广西大学，2008，硕士学位论文)公开了同时分离亚麻酸、亚油酸、油酸与硬脂酸的方法，HPLC条件为HC-C8液相色谱柱，柱温30°C,流动相乙腈水=87:13 (v/v),流速lml/min,检测波长242nm。该方法的缺陷表现为一、仅能同时分离6种混合脂肪酸中的4种；二、柱温条件较高，对色谱柱损耗较高，增加了分离成本。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对现有技术的不足提供一种高效液相色谱(HPLC)法分离并定量分析混合脂肪酸组成的方法。该方法仅使用常规HPLC仪器配置能同时分析出亚麻酸(C18:3)、棕榈油酸(C16:l)、亚油酸(C18:2)、油酸(C18:l)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)6种常见脂肪酸的组成含量，方法简单易行、运行成本经济节约。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下—种混合脂肪酸的高效液相色谱分离方法，首先将待测脂肪酸溶液用ω -溴代苯乙酮的丙酮溶液和三乙醇胺的丙酮溶液进行脂化处理得到待测液，再将待测液上样进行高效液相色谱分离，其特征在于所述混合脂肪酸由亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸、油酸、棕榈酸 或硬脂酸中的至少二种组成，所述高效液相色谱分离采用等度洗脱，流动相乙腈-水溶液，乙腈90% 95%、水10% 5%，C18柱，柱温10°C 20°C，检测波长242±5nm。HPLC分离效果主要由色谱分离条件决定，分离条件影响着被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱后样品分子与溶剂(即流动相或洗脱液)以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定了色谱过程的保留行为，从而决定了分离效果。色谱分离条件中以流动相组成、流速、色谱柱温度及洗脱方式最为重要。本技术方案采用HPLC分析脂肪酸组成，选择优化流动相组成、色谱柱温度、流动相流速等色谱分离条件。在流动相组分选择方面，本技术方案以乙腈为主的乙腈-水溶液为流动相。HPLC中流动相是液体，与组分间有亲合作用力，并参与固定相对组分的竞争，能提高柱的选择性、改善分离度，因此流动相的正确选用直接影响组分分离度。本技术方案以乙腈为主的乙腈-水溶液为流动相在脂肪酸的HPLC分析中至少有两点优点第一，低粘度。低粘度是流动相的优选方向，也是对流动相溶剂的基本要求之一。因为高粘度溶剂作为流动相势必增高柱压不利于分离，不利于系统的稳定运行，也不利于色谱柱的保护。乙腈的粘度虽然与甲醇相近，但是甲醇与水混合后粘度增高，而乙腈与水混合后粘度变化则不大。因此本技术方案中选用乙腈与水的混合物为流动相与甲醇与水的混合物作流动相相比，在同样的流速下不需增加柱压，优势明显；第二，低吸光度。在乙腈和甲醇的市销HPLC级和优级的吸收光谱中，乙腈HPLC级吸收最小，在UV检测时产生的噪声小，这一特征在短波长上最为显著。由于分析脂肪酸正是短波长区，因此本技术方案选用乙腈为流动相能够提高HPLC在脂肪酸分析中的灵敏度。并且乙腈HPLC级在UV检测中的梯度基线上产生鬼峰少，对色谱图分析的干扰小。在洗脱梯度方面，本技术方案采用等度洗脱，即在同一分析周期内流动相组成保持恒定，以固定配比的溶剂系统洗脱组分。这样不仅稳定性高、色谱重现性好，并且方法操作简便也易于色谱柱再生，在系统运行时还可以实现流动相的循环利用(根据检测的具体情况，确定循环的次数)，能够节约方法运用的成本。在色谱柱温度选择方面，本技术方案采用柱温10°C 20°C，与《蚕蛹混合脂肪酸中a-亚麻酸的分离纯化》公开的柱温柱温30°C条件有本质区别。色谱柱温度因为影响容量因子k'而影响分离度，是影响HPLC分离效果的最要因子。为了实现分离效果，在HPLC
，一种HPLC分离方法的柱温条件的限定通常不会超过5°C范围，而本专利技术方法通过实施例证明，配合其它色谱条件，本技术方案的柱温可以在10°C范围内变化依然能实现6种脂肪酸的同时分离。由于柱温条件影响溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度等，因此宽范围的柱温取值能够使本技术方案具有更宽的适用范围，也提供了方法实施者更多的试验条件选择，并且选择较低的柱温能够有效保护色谱柱，降低分离成本。本技术方案的优选柱温条件为15°C。在流动相流速选择方面，流动相的不同流速会影响分离度，一般而言将流动相控制在较低的流速范围内可以使两物质的保留时间显著延长，有利于提高分离度。但由于保留时间变长所有纵向扩散会明显增加，表现为峰型矮胖，并且本文档来自技高网...

【技术保护点】
混合脂肪酸的高效液相色谱分离方法，首先将待测脂肪酸溶液用ω？溴代苯乙酮的丙酮溶液和三乙醇胺的丙酮溶液进行脂化处理得到待测液，再将待测液上样进行高效液相色谱分离，其特征在于：所述混合脂肪酸由亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸、油酸、棕榈酸或硬脂酸中的至少二种组成，所述高效液相色谱分离采用等度洗脱，流动相为乙腈？水溶液，乙腈90%～95%、水10%～5%，C18柱，柱温10℃～20℃，检测波长242±5nm。

【技术特征摘要】
1.混合脂肪酸的高效液相色谱分离方法，首先将待测脂肪酸溶液用ω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和三乙醇胺的丙酮溶液进行脂化处理得到待测液，再将待测液上样进行高效液相色谱分离，其特征在于所述混合脂肪酸由亚麻酸、棕榈油酸、亚油酸、油酸、棕榈酸或硬脂酸中的至少二种组成，所述高效液相色谱分离采用等度洗脱，流动相为乙腈-水溶液，乙腈90% 95%、水 10% 5%，C18 柱，柱温 10°C 20°C，检测波长 242±5nm。2.根据权利要求I所述的分离方法，其特征在于所述流动相为如下二种溶液之一 一、乙腈-水溶液，乙腈水=95%:5% ； 二、乙腈-水溶液，乙腈水=90%:10%ο3.根据权利要求I或2所述的分离方法，其特征在于柱温15°C。4.根据权利要求3所述的分离方法，其特征在于采用如下步骤进行 51、脂肪酸脂化处理 取25 4 1脂肪酸溶液至试管中，氮气吹干，加入101^/1111 ω-溴代苯乙酮的丙酮溶液和10mg/ml三乙醇胺的丙酮溶液各...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗培高，邓科君，张勇，胡学运，陈俊伯，任正隆，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：