本发明专利技术涉及单核细胞增生李斯特菌物种的遗传修饰细菌，其中转录因子PrfA的基因组基因座已经被删除，其特征在于，它在基因组水平包含起内部扩增对照物作用的人工序列，本发明专利技术也涉及该细菌的用途、以及用于定性地和/或定量地检测和测定野生型单核细胞增生李斯特菌在疑似被所述微生物污染的样品中的存在的方法和试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单核细胞增生李斯特菌物种的遗传修饰细菌本专利技术涉及单核细胞增生李斯特菌(Zi1Sieria monocytogenes)物种的遗传修饰细菌，其中转录因子PrfA的基因组基因座已经被删除，其特征在于，它在基因组水平包含起内部扩增对照物作用的人工序列，本专利技术也涉及该细菌的用途、以及用于定性地和/或定量地检测和测定野生型单核细胞增生李斯特菌在疑似被所述微生物污染的样品中的存在的方法和试剂盒。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌是一种致病性的革兰氏阳性细菌。因为造成利斯特菌病，它是最致命的食物传播的病原体之一。诸如食物样品或临床样品(如血液、组织或粪便)等样品中的病原体的检测，日益变得重要。但是，为了清楚地鉴别和任选地定量在样品中包含的细胞，必须提供用于它们的检测和定量的可靠方法。·自聚合酶链式反应(PCR)的首次实现以来，该分子生物学工具已经发展成为改进的微生物检测提供许多机会的方法。基于PCR的方法要变成国际公认标准的一个重要的必要条件是，内部扩增对照物(IAC)。IAC是存在于同一样品试管中的非靶物DNA序列，其与靶序列同时共同扩增。在没有IAC的PCR中，阴性结果是不确定的，因为它可以表示，没有靶序列存在，但是也可以表示，扩增反应被各种因素抑制。因此，欧洲标准化委员会(European StandardizationCommittee)协同国际标准组织(International Standard Organisation, ISO)提出了诊断性PCR的一般指南，该指南要求IAC的存在(IS0/DIS 22174)。IAC应当能够竞争使用相同的引物结合位点作为靶PCR，并在实时PCR中借助于使用的探针染料的长度和荧光波长可清楚地与靶DNA扩增子辨别开。总之，所述对照物的特征应当接近靶物的特征，尽管如此，还会确保对靶物检测的可忽略不计的干扰。IAC在PCR试验中的应用，会确保阴性结果的可靠性；但是，仅仅对于在PCR中促进靶物扩增的酶反应而言，和对于以在实时PCR中使用荧光探针为基础的定量和确认检测反应而言，确实如此。但是，这类对照物没有覆盖最初的方法步骤(诸如样品制备和从样品基体中分离/纯化DNA)，如果要覆盖的话，通过外部对照物进行检查。这没有考虑到单个样品的对照物，因而阴性结果暗示研究的样品(例如食物)的病原体状态的假验证的可能性。因此，内部样品过程对照物(ISPC)是必要的，其应当覆盖使用常规或实时PCR对病原体进行可靠定量检测所必需的所有方法步骤。就食物和水传播的RNA病毒的检测而言，已经报道了猫嵌杯样病毒和噬菌体MS2 作为内部对照物的用途(Mattison 等人(2009) Int. J. Food Microbiol. 132，73-77; Di 等人(2010) J. Virol. Methods 165，57-63; Dreier 等人(2005) J. Clin.Microbiol. 43， 4551-4557)。Murphy 等人(2007，Int. J. Food Microbiol. 120, 110-119)公开了一种细菌内部样品过程对照物，其用于检测单核细胞增生李斯特菌和肠道沙门氏菌(Salmonellaenterica)。该对照物是基于包括肠道沙门氏菌的绿荧光基因(gfp)片段和iroB基因片段的重组大肠杆菌菌株。所述对照物没有用于定量目的，作为基础的革兰氏阴性的大肠杆菌菌株在样品制备过程中会表现出与单核细胞增生李斯特菌相比不同的特征。结果，需要新的可靠方法，所述方法允许通过实时PCR来检测和定量被污染样品中的病原体单核细胞增生李斯特菌。已经意外地发现，通过使用IAC+、Δ -prfA单核细胞增生李斯特菌EOTe菌株作为覆盖整个检测过程的内部过程对照物，可以解决该问题。
技术实现思路
因此，本专利技术的第一方面是单核细胞增生李斯特菌物种的遗传修饰细菌，其中转录因子PrfA的基因组基因座已经被删除，其特征在于，它在基因组水平包含起内部扩增对照物(IAC)作用的人工序列。·单核细胞增生李斯特菌物种的遗传修饰细菌是指，使用基因工程技术改变它的遗传物质而产生的单核细胞增生李斯特菌物种。遗传修饰包括插入和/或删除基因。例如，可以如在 BSckmann 等人(1996) Mol. Microbiol. 22, 643-653 中所公开地,删除 prfA 基因。转录因子PrfA的基因组基因座是指，编码蛋白PrfA的核酸序列。这是705碱基对的序列(Leimeister-Wjichter 等人，1990; Proc Natl Acad Sci USA, 87, 8336-40;Glaser等人，2001; Science, 294，849-52)。该基因位于在单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌溶血素基因(IisA) (GeneID: 987031; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/98703l#pageTop)周围的染色体区域内。关于转录因子PrfA的信息也参见Scortti等人(2007) Microbes and Infection 9, 1196-1207,它通过引用并入本文。PrfA 控制单核细胞增生李斯特菌的关键毒力决定簇的表达。PrfA是27 kDa的237残基蛋白。从基因组基因座中删除转录因子PrfA，会使该突变体成为非病原体。根据本专利技术，内部扩增对照物(IAC)是指，在PCR反应过程中存在于样品试管中并与某些祀序列一起共扩增的人工核酸序列，正如Hoorfar等人(2003) Lett. Appl.Microbiol. 38，79-80所定义的。IAC的存在，允许测定假阴性结果。所述IAC序列可以是任意多核苷酸序列。该序列的大小可以变化，这取决于具体的PCR试验及其反应条件。所述IAC序列优选地是单拷贝核苷酸序列，即在单核细胞增生李斯特菌细菌的单倍体基因组中仅出现I次的核苷酸序列。优选地，所述IAC序列是这样的序列所述序列不存在于单核细胞增生李斯特菌或预期天然存在于待测样品中的任何其它物种中，也不存在于样品基体本身中。优选地，所述IAC序列包括在5’和3’末端处的引物结合序列。根据本专利技术，优选地，所述IAC是竞争性IAC，即在相同条件下，在同一PCR管中，在实时PCR过程中，遗传修饰的单核细胞增生李斯特菌的IAC和野生型单核细胞增生李斯特菌的靶序列prfA用一组共同的引物进行扩增。因此，所述IAC的引物结合序列特别优选地与野生型单核细胞增生李斯特菌的基因组PrfA基因座的引物结合序列相同。在本专利技术的一个非常特别优选的实施方案中，所述人工IAC序列是根据SEQ IDNO: I 的 100 bp 序歹Ij 5Λ-GAT ACA GAA ACA TCG GTT GGC GTA TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCG CTA TGAAGA GAT ACG CGG TGG AAC CTG GAA CCT GAT GGC ATC AAG ATT ACA C-3^。该IAC 序列公开在 Rossmanith 等人(2006) Res. Microbiol. 157, 763-771 中。根据本专利技术，可以使用与SEQ ID NO: I具有超过本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：P罗斯马尼特，K弗吕维尔特，M瓦格纳，S富克斯，
申请(专利权)人：默克专利股份公司，
类型：
国别省市：
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