本发明专利技术提供了一组变异的人类SLC20A2基因，并揭示了该变异的人类SLC20A2基因为特发性脑基底节钙化疾病的致病基因。利用该变异的人类SLC20A2基因，可以对特发性基底节钙化疾病进行诊断和患病风险评价。本发明专利技术还提供了由所述的变异的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质，该蛋白质可作为治疗该类基底节钙化的药物靶点。此外，本发明专利技术还提供了用于特发性基底节钙化疾病诊断的试剂盒，以及变异的人类SLC20A2基因在制备人类特发性基底节钙化疾病基因诊断芯片中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人体变异的基因，即人类特发性基底节钙化(IBGC)致病基因SLC20A2。本专利技术还涉及这种变异基因及其编码的蛋白在检测和作为治疗IBGC疾病的药物靶点中的作用和意义。
技术介绍
特发性脑基底节I丐化(IdiopathicBasal Ganglia Calcification, IBGC)俗称Fahr病，是一种先天性神经系统锥体外系疾病，大脑X-射线电子计算机断层扫描(CT)发现率为1-2% 。大多数IBGC家系表现为常染色体显性遗传方式，也有常染色体隐性遗传和性染色体连锁遗传的报道。IBGC症在CT上表现为大脑双侧对称性基底节钙化。常见钙化部位的发生顺序是苍白球、尾状核、壳核、丘脑、额顶叶脑回底部、齿状核、小脑皮层、脑干中央部及侧脑室周围，在CT上可表现为卵圆形和或八字形高密度影，常为对称性。患者运动能力逐渐受损或丧失，智力和意识表现痴呆、癫痫、精神障碍等，目前尚未有针对性药物治疗该病。其发病机制不清楚，对其进行分子遗传学研究有望克隆其致病基因，为寻找药靶、开发相关药物及治疗该病奠定基础。目前该病定位3个致病位点14ql3 (IBGCl)、2q37(IBGC2)和8p21. 1-qll. 23(IBGC3)，其中IBGC3位点是我们定位的。该病的致病基因尚未克隆，因此对IBGC致病基因进行系统研究，将对大脑基底节钙化的诊断、开发针对性的药物及治疗具有十分重要理论和实践意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供IBGC致病基因，定位出该疾病的基因突变位点，以及利用该疾病的基因突变位点检测人体中是否存在该基因突变的方法。同时提供IBGC致病基因编码的蛋白质序列及其突变导致的细胞磷吸收下降，为阐明该病的致病机制提供了基础，为进一步治疗该病提供了设计药物的靶点。本专利技术真对收集并鉴定的一个IBGC大家系进行微卫星标记的连锁分析，排除了与IBGCl和IBGC2的连锁关系，但将该家系的致病基因定位于IBGC3位点，进一步连锁缩短了 IBGC3位点即将8p21. 1-qll. 23 (25Mb物理图距，12. 29cM遗传图距)缩短在.8pl2-qll. 23(19. 5Mb物理图距，6. 40cM遗传图距)染色体区段。本专利技术对定位于8pl2-qll. 23区域内特发性基底节钙化的41个候选基因进行双向测序，在第一个家系中发现SLC20A2基因一个点突变；在第二、三个家系中，发现该基因三个新点突变，第二个家系先征者存在两个点突变，一个突变来自父亲，第二个突变来自母亲。随后在巴西和西班牙IBGC家系中发现该基因四个新的突变包括两个缺失突变和两个点突变。上述的八个突变分别在各自家系中所有患者的DNA样品上均得到验证，在家系正常成员、508例正常汉族人群和96例欧洲人群中不存在上述突变，排除了单个核苷酸多态性的可能性。同时发现这些突变造成所编码的氨基酸缺失、移码和改变，由此，本专利技术提供了 8种如SEQ ID NO 2~9所示的变异的人类SLC20A2基因，其特征分别在于，所述SLC20A2基因编码区第124-126缺失3个碱基(鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤即GTG)、第362位胞嘧啶被鸟嘌呤替换(C > G)、1409位胞嘧啶碱基缺失(delC)、1492位鸟嘌呤碱基被腺嘌呤替换(G > A)、第1723位鸟嘌呤碱基被腺嘌呤替换(G > A)、第1784位胞嘧啶碱基被胸腺嘧啶替换(C > T)、第1802位胞嘧啶碱基被鸟嘌呤或胸腺嘧啶替换(C >G/T)。正常的人类SLC20A2基因的核苷酸序列如SEQ ID ΝΟ:1所示。本专利技术提供了 8种如SEQ ID NO :45_52所示的变异的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质序列，其特征分别在于，SLC20A2蛋白的氨基酸序列分别是第42位Val缺失(p. V42del)、第 121 位的 Ser 变为 Cys (p. S121C)、从 470 位的 Pro 移码(p. P470Lf sX37) 37个氨基酸终止、第498的Gly突变为Arg (p. G498R)、第575位Glu突变为Lys (p. E575K)、第595位的Thr突变为Met (p. T595M)及第601位的Ser突变为Trp或Leu (p. S601W/L)。正常的人类SLC20A2基因所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 44所示。本专利技术还提供了一种检测来源于人体的生物样本中是否存在所述基因的突变方法，其步骤(1)从所述样本中提取和纯化基因材料；(2)对所述基因材料进行聚合酶链扩增(PCR)反应，获取PCR产物； (3)对所述PCR产物进行核苷酸序列测定，与SEQ ID NO : I序列比对，以确定所述生物样本中是否含有SLC20A2基因突变。优选地，所述生物样本为体液，该体液包括但不限于血液、血浆、羊水、淋巴液等。优选地，所述体液为血液。优选地，在上述PCR反应中使用的引物对为SEQ ID NO :10和11 ;12和13 ;22和23 ;26和27 ;28和29。本领域技术人员还可以使用SEQ ID NO :14和15 ;16和17 ;18和19 ；20和21 ；24和25的引物对扩增相应核苷酸序列。本专利技术还提供了检测来源人体的生物样本中是否存在上述八种突变的方法，其步骤包括1)从所述样本中提取和纯化基因材料；(2)对所述基因材料进行聚合酶链扩增(PCR)反应，获取PCR产物；(3)对所述PCR产物进行限制性内切酶酶切；(4)对所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察和拍照电泳图，与表2相关酶切产物大小比对，以确定所述生物样本中是否含有SLC20A2基因上述八种突变。优选地，所述体液为血液或羊水。优选地，在上述PCR反应中使用的引物对为SEQ ID NO :30和31 ;32和33;34和35 ；36 和 37 ；38 和 39 ；40 和 41 ；42 和 43。优选地，上述PCR产物中使用的6种限制性内切酶Hpa I、EcoR I、Bam HI、HindIII、Sph I 和 Sac I。本专利技术还提供了变异的人类SLC20A2基因功能改变，如附图6所示，该基因编码的蛋白是分布在细胞膜上钠磷共转体，对细胞维持磷的内稳态非常重要，SLC20A2基因突变导致该共转体功能下降，从而导致细胞对磷的吸收下降(见实施例4)，打破了这种内稳态，使细胞外积累大量的无机磷以至于与基质中钙结合形成磷酸钙颗粒，长期积累而导致基底节钙化。因此人类SLC20A2变异基因可以作为药物的靶点，开发相关药物治疗人类大脑基底节钙化提供了科学依据。根据专利技术人提供的SLC20A2基因序列变异的位点，应用本专利技术提供的检测来源于人体的生物样本中是否存在所述基因的突变方法，对七个特发性基底节钙化家系所有个体进行突变检测。结果发现八个突变包括两个缺失突变和六个点突变，而家系正常成员、508例正常汉族个体和96例欧洲个体中不存在上述突变。证明本专利技术提供的方法能够精确诊断由SLC20A2基因突变导致的IBGC疾病。同时对该基因突变所编码的蛋白质进行功能分析，发现SLC20A2突变会导致细胞对磷的吸收下降，从而导致人的基底节钙化。一方面为颅内钙化患者是否是该基因突变导致的提供病本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种变异的人类SLC20A2基因，其核苷酸序列为SEQ？ID？NO：2至9中任一序列所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘静宇，张学，王程，李雨雷，石磊，任杰，
申请(专利权)人：武汉淘智生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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