一种转化茴香脑生成茴香酸的菌株及其筛选方法和应用，从八角林土壤中采用不同浓度的茴脑浓度梯度的富集培养基进行富集，再接种到含有5g/L茴脑的筛选培养基上进行平板筛选，转接到种子培养基中于28℃摇瓶培养12h，再转接至发酵培养基中摇瓶培养，培养温度为28℃，培养时间为48h，采用气相色谱法定量测出茴香酸含量，选出产茴香酸高的菌株（BurkholderiaspWGB31）。经过发酵条件优化得到的茴香酸生成率为28.75%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物应用领域。具体是一种转化茴香脑生成茴香酸菌株及发酵产回香酸的方法，
技术介绍
茴香脑是茴香油的主要成分，通过深加工可以制取高附加值的茴香醛、茴香酸和茴香醇及其各种衍生物，茴脑等相关化合物广泛应用于食品、化妆品、香料、医药和化工等多种领域。茴香醛和茴香酸广泛用于合成香精香料、电镀金属的光亮剂同时还是合成多种西药的中间体，具有较高的价值。目前茴香醛和茴香酸的生产主要为化学合成法(主要为氧化法)，生产率低，副产物多，不仅浪费资源而且污染环境。生物转化法作为一种绿色、环境友好型的生产方法，在转化茴脑合成茴香醛、茴香酸等化合物方面具有良好的发展前景。关于茴香脑的代谢，只在近十年才逐渐开展起来的。目前报道能代谢反式茴 香脑的微生物菌种有 Arthrobacter TA13、Pseudomonas putida JYR-1、黑曲霉 ZJ-9 和Pseudomonas BT-13。Shimoni E等[从土壤中获得一株能转化反式茴脑的细菌菌株TA13,经16S rDNA序列分析,鉴定为节杆菌Arthrobacter sp.。此外,他们还研究了 ArthrobacterTA13及其诱变菌株代谢反式茴脑的途径，根据代谢产物推断了一条茴香脑环氧化后双键断裂的代谢途径，诱变菌株能将异丁子香酚转化生成香草醛和香草酸，以反式茴脑、茴香醇和茴香醒作为碳源可高产茴香酸。Ryu等报道在Pseudomonas putida JYR-I代谢茴香脑的转化液中，检测到了茴香脑环氧化合物、茴香酸及对羟基苯甲酸。国内陈敏开展了微生物降解茴脑的筛选，获得一株茴香醛产率较高的菌株，初步鉴定菌株ZJ-9为真菌黑曲霉，经转化条件的优化，茴香醛的摩尔转化率达4. 54%。粟桂娇等以广西盛产的八角茴香油为碳源，开展了生物降解反式茴脑的菌株筛选工作，获得一株细菌菌株BT-13，经形态学、生理生化实验和16S rDNA序列分析,初步鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.。同时考察了假单胞菌BT-13在有机溶剂-水两相系统中的转化，经发酵条件优化，茴香醛的摩尔转化率可达7. 7%，利用固定化细胞技术在两相系统中转化，茴香醛的产量有所提高，达12. 6%。广西盛产天然植物八角，八角和八角茴香油的产量居全国第一,这为我国以天然茴香脑生产茴香醛提供了充足的原料保证。本专利技术以广西盛产的八角茴香油为原料，进行微生物转化茴脑生成茴香酸的菌株筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种转化茴香脑生成茴香酸的菌株。本专利技术的另一个目的是提供上述菌株的筛选方法。本专利技术还有一个目的是利用该菌株生物转化茴香脑生产茴香酸的方法，通过对发酵条件的优化提高茴香酸的产量。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种转化茴香脑生成茴香酸的菌株，分类命名为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp) WGB31，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO. M 2012060，保藏日期是2012年3月12日。转化茴香脑生成茴香酸的菌株(Burkholderia spWGB31),简称为 WGB31,下述同。一种转化茴香脑生成茴香酸的菌株是从广西八角林土壤中筛选得到。所述的转化茴香脑生成茴香酸的菌株(Burkholderia spWGB31)的筛选方法,包括如下步骤从八角林土壤中采用不同浓度的茴脑浓度梯度的富集培养基进行富集，再接种到含有5g/L茴脑的筛选培养基上进行平板筛选，转接到种子培养基中于28°C摇瓶培养12h，再转接至发酵培养基中摇瓶培养，培养温度为28°C，培养时间为48h，采用气相色谱法定量测出茴香酸含量，选出产茴香酸高的菌株。所述富集培养基的组分及含量为葡萄糖20g、蛋白胨10g、K2HPO4 · 3H201g、NaClO. 5g、MgSO4 · 7H20 0. 5g、FeSO4O. Olg、酵母浸出粉 2. 5g，蒸馏水定容至 IOOOmL, pH 为 7. 0。所述种子培养基的组分及含量为胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g,蒸馏·水定容至IOOOmL, pH为7. O。所述发酵培养基的组分及含量为葡萄糖6g，蛋白胨8g，牛肉膏2. 5g，KH2P041.0g，NaCl 0. 5g, MgSO4O. 5g, FeSO4O. Olg,茴香脑 4g/L,蒸懼水定容至 IOOOmLo所述转化茴香脑生成茴香酸的菌株(Burkholderia spWGB31)在转化茴脑生成茴香酸中的应用。茴香酸薄层层析检测发酵液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，充分摇匀后在8000转/分钟下离心5分钟，取上相点样于硅胶板GF254，检测是否有茴香酸的斑点出现。茴香酸气相色谱检测发酵液中加入等体积的乙酸乙酯萃取，取上相，用气相色谱法检测茴脑的降解率及茴香醛的摩尔生成率。茴脑的降解率=(初始茴脑的摩尔数一残余茴脑的摩尔数)/初始茴脑的摩尔数 X 100%茴香醛的生成率=生成茴香醛的摩尔数/初始茴脑的摩尔数X 100%利用所述的菌株发酵生产茴香酸的方法，包括下述步骤(I)、平板保存培养将菌株划线到固体平板培养基上，30°C倒置培养24_36h，保存于4°C冰箱以及用于种子培养基的接种。(2)、种子培养于250mL的三角瓶中装入50_80mL的种子培养基，灭菌冷却后，接入平板保存的菌株，30°C，摇床培养，摇床转速为160-200转/分钟，培养时间为12-20h。培养物用于发酵培养的接种。(3)、发酵培养容积为200mL的发酵瓶中装入61. 22mL的发酵培养基，接入经种子培养的菌液7-10%(v/v)，培养温度为30°C，培养时间为16-24h，转速为160-200转/分钟，分离提取茴香酸。所述的发酵培养基组分为葡萄糖5g，蛋白胨6g，KH2PO4L 0g, NaCl 0. 5g，MgSO4O. 5g, FeSO4O. 01g，茴香脑3_5g/L，pH为6· 23，蒸馏水定容至IOOOmL0上述(3)中所述的发酵条件是通过以下步骤实现的针对WGB31转化茴香脑生成茴香酸的发酵过程进行单因素试验，选取了 3个主要影响因子葡萄糖浓度，pH,装液量。使用Design-Expert进行实验优化设计,得到17个实验，依据这17个实验给出的葡萄糖浓度，pH和装液量分别进行这17个发酵实验，经过以上实验得出茴香酸含量之后通过软件建模并运算得出最优化条件葡萄糖、pH、装液量分别为6. 01g/L、6. 23,61. 22mL时，茴香酸产量达到最大值。本专利技术的有益效果提供一种能利用茴香脑转化生成茴香酸的菌株，通过对发酵条件的优化，能在含有茴香脑的发酵培养基中转化茴脑生成茴香酸。具体实施例方式以下面通过实施例对本专利技术作进一步详细说明，但对本专利技术没有限制。实施例I菌株的筛选每份采集到的土壤样品称取5g加入已灭菌的富集培养基中，30°C摇床200rpm培养72h。将菌液按10%接种量转接到新鲜的富集培养中，经三次茴脑浓度梯度富集培养， 取ImL富集培养物，用无菌水进行梯度稀释，取10_5、10_6和10_7三个浓度，涂布于基本培养基平板上，30°C倒置培养3-5天。挑取平板上的单菌落，接种到IOml基本培养基的指形瓶中，添加4g/L茴脑，30°C摇床200rpm培养48h，划线于基本培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转化茴香脑生成茴香酸的菌株（Burkholderia？spWGB31），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？M？2012060。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：武波，申佩弘，曾华贺，宋张杨，蒋承建，唐咸来，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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