本发明专利技术提供了一种RNA的预备模板PCR（Template-Ready?PCR，TRPCR）检测方法。本发明专利技术方法与采用传统的RT-PCR方法相比，不需要纯化抽提RNA，不需要进行逆转录反应，将原本长达3个小时以上的PCR前处理过程缩短为约50分钟，因此，操作简便快速易行，具有较高的RNA检测的灵敏度和特异性，适合对各种来源的样品裂解得到RNA进行检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种RNA的预备模板PCR (Template-Ready PCR, TRPCR)检测方法。
技术介绍
RNA是遗传信息传递的载体。RT-PCR (reverse transcription逆转录-聚合酶链反应)，指将逆转录反应(Reverse Transcription, RT)和 PCR (Polymerase ChainReaction)反应组合在一起的方法.RT- PCR将以RNA为模板的cDNA合成，即RT，同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RNA的RT-PCR检测或定量分析，比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及SI核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作，已发展成为进行基因表达水平的检测分析，病原体的检测分析等 有力的手段。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly (A) +RNA.其中RT需要用逆转录酶，可以用随机引物、oligo (dT)或基因特异性的引物(GSP)起始.RT和PCR可以在两个反应管中分步先后进行(两管法)，也可以在一个反应管中先后进行(一管法)。两管法比较常见，在两管法RT-PCR中，每一步都可以尽量在最佳条件下进行，但由于RT体系中含有PCR抑制物，所以一般只能取出约5%的RT产物进行PCR，这限制了最终检测的灵敏度，但在使用一个样品检测多个目标RNA时比较很有用——因为一个RT产物可以分别用于很多个PCR反应。一管法RT-PCR中，RT和PCR在一只管中进行，必须尽可能地提供同时为逆转录和PCR优化的条件.一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖.一步法优化成功的话，可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0. Ipg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增-理论上灵敏度可以比两管法提高20倍.然而，为一步法RT-PCR优化的条件很难掌控，经常会带来严重的非特异扩增，而且成本上有很大提升.虽然RT-PCR在科研领域的推广普及程度很高，但在临床检测应用方面，仍存在很大的改进空间.主要问题包括步骤繁琐，对操作要求高，特别是2种酶促反应(RT和PCR)的最优反应条件是有差异的，容易受到各种抑制物质的影响，也容易受到非特异扩增和假阳性的困扰，最后，逆转录酶的价格居高不下，操作成本很难降下来.
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种操作简单快速、特异性强的用于RNA检测的预备模板PC检测方法。本专利技术采用的技术方案是一种RNA的预备模板PCR检测方法，所述方法包括(I)设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25 40mer的单链寡核苷酸DNA，记为探针A ;探针A的GC含量为40-60%，解链温度(Tm值)为70_85°C ;将探针A锚定在PCR管内，得到锚定PCR管；探针A的锚定可以采用本领域常规方法进行，用于锚定探针A的固体介质，可以是塑料离心管，也可以是磁珠，凝胶颗粒或其他可以吸附结合核酸的固体介质；(2)设计部分序列与目标RNA上任意的另一段序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为两端是特异的长度为2(T30mer的PCR引物序列、中间为与目标RNA互补的长度为25 40merbp的序列，记为探针B ;探针B的GC含量为40_60%，解链温度(Tm值)为70_85°C，与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠。(3)取待测样本，加入探针B和裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min, 4°C离心，取上清液，得到裂解上清液；所述裂解液为本领域常规含有表面活性剂(如吐温20、NP-40等)、用于细胞或组织裂解的缓冲液；待测样本可来自组织或细胞，或者临床标本如痰液、血液等； 待测样本来自痰液时，裂解上清液获得方法如下1飞ml痰液+ 5^10 ml痰融液，37。。振荡IOmin, 4°C >5000 rpm离心IOmin,弃上清,取沉淀+ 200 ul裂解液(其中探针8浓度为1_01/1)，反复吸打，转移到1.5 ml离心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；痰融液组成PBS+O. 1% (w/vol)DTT0待测样本来自细胞时，裂解上清液获得方法如下24孔板细胞培养，吸去培养液，+ 200ul裂解液(其中探针B浓度为lnmol/Lol/L)，反复吸打，转移到1.5 ml离心管中，冰上放置20min，4°C、15000 rpm离心20min，取上清，得到裂解上清液；待测样本来自组织时，裂解上清液获得方法如下取约0. lmmol/L3大小的组织块放入I. 5 ml离心管中，+ 200ul裂解液(其中探针B浓度为lnmol/Lol/L)，用吸头捣碎组织，室温振荡IOmin, 4°C、15000 rpm离心20min,取上清,得到裂解上清液；(4)取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，6(T70°C保温5 15min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤3、次，吸干，加入20uL由PCR缓冲液和PCR引物(该PCR引物即与探针B两端的PCR引物序列相同的引物对)配制的PCR反应液(PCR反应液中引物对浓度为0. 2umol/Lol/L)，进行PCR扩增，扩增产物进行SYBR荧光定量分析；所述缓冲液为PCR反应常规缓冲液；所述洗涤液可为本领域常规含有表面活性剂(如吐温20、NP-40等)的缓冲液。在杂交反应之后，通过多次反复的洗涤，在洗去未杂交结合的核酸的同时，也洗去了其他可能干扰PCR反应的物质，从而保证了 PCR反应的特异性和成功率；(5)以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤(I)和(2)方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。本专利技术方法原理如下(1)预先制备好与目标RNA上一段序列互补的锚定探针——探针A ;探针A被固定在PCR管壁，磁珠或其他可吸附结合核酸的固体介质上，作用是通过特异性地结合目标RNA,将目标RNA选择性地吸附在固体介质上；(2)与目标RNA上另一段序列互补的模板探针——探针B ;探针B两端带有PCR引物序列，使用时是添加在裂解液中的；当细胞被裂解后，探针B通过部分杂交与目标RNA结合，这样探针B也就被选择性地吸附在上述固体介质上；(3)在杂交反应之后，经过反复清洗，只有能与探针A互补杂交结合的目标RNA分子及与该RNA杂交结合的探针B留在反应管中；(4)由于探针B两端带有PCR引物序列，这样加入PCR反应液后，以探针B为模板，不需要RT，可直接进行PCR反应。优选的，所述裂解液组成如下l%(w/vol)SDS, 500mmol/Lol/L NaCl, 2mmol/Lol/L MgCI o, 10mmol /LoI /T, 2_ 疏基乙醇，0. lmg/ml 鱼精 DNA (市购)，0. 1% (vol/vol)Tween20,1% (w/vol)脱脂奶粉，溶剂为 10mmol/Lol/L、pH7. 5 的 Tris-HCl。优选的，所述PCR 缓冲液组成如下50mmol/Lol/L KCl, I. 5mmol/Lol/L MgCl2,0.2mmol/Lol/L dNTP，5% (vol/vol) DMSO,0. 05% (vol/vol本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种RNA的预备模板PCR检测方法，所述方法包括：（1）设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25~40mer的单链寡核苷酸DNA，记为探针A；探针A的GC含量为40~60%，解链温度为70~85℃；将探针A锚定在PCR管内，得到锚定PCR管；（2）设计部分序列与目标RNA上另一段任意序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为:？两端是特异的长度为20~30mer的PCR引物序列、中间为与目标RNA互补的长度为25~40mer的序列，记为探针B；探针B？的GC含量为40~60%，解链温度为70~85℃，与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠；（3）取待测样本，加入探针B和含表面活性剂的细胞裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；（4）取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，60~70℃保温5~15min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤3~9次，吸干，加入20uL？由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行荧光定量分析；（5）以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（1）和（2）方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈燃，伍迪，金晓铮，
申请(专利权)人：浙江今复康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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