本发明专利技术公开了一种改进的植物花粉管转化方法，分别采用氢氧化铝溶胶、磷酸钙和Tween20作为外源质粒DNA保护剂，利用植物花粉管通道法转化外源基因，受体烟草和大豆GUS活性组织化学染色结果表明，以氢氧化铝溶胶作为DNA保护剂的gus阳性率分别为11.1%和3.78%；以磷酸钙作为DNA保护剂的gus阳性率分别为8.89%和2.91%；以Tween20作为DNA保护剂的gus阳性率分别为10.0%和1.41%；以1×SSC溶液作为DNA保护剂的gus阳性率分别为7.78%和1.97%，解决了植物花粉管通道法转化率低的问题，提高了转化率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术遗传育种领域，具体涉及。
技术介绍
1981年，我国的科学家周光宇首次应用花粉管通道法将外源DNA导入陆地棉中，成功培育出抗枯萎病的转基因品种。近年来，花粉管通道法因其独特的优势，被科学家们广泛的利用，进行植株的转基因操作。该方法有以下几个优点首先，花粉管通道法适用范围较广，可以应用到任何开花的植物中，并且可以在不同物种之间进行不同的基因转移，因此其放宽了目的基因和受体植株的范围。第二，其不依靠繁琐的植物组织培养和诱导植物再生的漫长过程，花粉管通道法利用的是自然的生殖过程，可直接获得转化过的转基因种子，简捷、快速。第三，该方法应用于植株转化时，大大加快了转化速度。对于大多数植株而言，从其开花到转基因种子的收获平均在3-4个月的时间。即在当年即可收获转基因种子，并 进行检测。第四，操作简捷，技术易掌握，同时不需要昂贵的设备，因此可以应用于大面积植株的遗传转化。但是该方法在具体的实际应用中，还有一定的缺陷，即该方法转化效率不高，在转化过程中，外源质粒DNA易降解。DNA保护剂主要是一类可以保护抗原的物质，特别是DNA、RNA不受体内酶的分解。DNA保护剂包括氢氧化铝明胶、磷酸钙和乳油保护剂。而在医学中，铝盐佐剂是被允许应用于人类的佐剂。利用这类铝盐胶体，抗原会跟一个不溶的凝胶沉淀剂结合，或者经过相互的电作用形成凝胶粒子。该保护剂的作用原理是因其是一个暂时的储存库，缓释是其非常重要的一个功能。它可以将抗原包裹住，可以避免抗原分子被降解，同时可以避免受体内的清除作用而丧失。乳油保护剂一般是用矿物油、稳定剂及乳化剂(如TWeen20、Tween80及SpanSO)按照一定的比例进行混合，然后与抗原混合制成。这类保护剂是一种油包水的乳齐U，它可以作为一个保存库，避免抗原被水相中的机体水解，进而到达抗原被保护的目的。而传统的花粉管通道法，大多用I X SSC溶液作为回溶剂，回溶目的基因或质粒。
技术实现思路
本专利技术的目的是为解决花粉管通道法在转化过程中，外源质粒DNA易降解，转化效率不高的问题，而提供。，其特征在于将外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，制成外源质粒DNA的混合液；浓度为0. 8-1. 2 u g/y L，然后利用植物花粉管通道法转化到植物中； 所述的外源质粒DNA保护剂，它是氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和Tween20保护剂中的一种； 所述的外源质粒DNA的浓度为I y g/ y L。所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的(I)在一支玻璃试管中加入2-4mL 1%氯化铝溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀； (2)弃上清，用蒸馏水清洗沉淀3-5次，采用倾析法除去水分，最后一次用过滤法使洗液与沉淀分离；(3)将沉淀转入150mL烧杯中，加入蒸懼水20-80 mL,搅拌并加热煮沸。期间加入0.1-0. 2 mL 0. I mol/L HCl溶液，不断搅拌，即可获得氢氧化铝溶胶； (4)氢氧化铝溶胶重悬外源质粒DNA。所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的 (1)用灭菌蒸馏水5-15u L重悬外源质粒DNA，使其浓度为I y g/ y L，再加入50-60U L 2 mol/L CaCl2 溶液混匀； (2)离心，将上清液取出，加入到400-450UL灭菌蒸馏水中；得外源质粒DNA-CaCl2溶液； (3)取一个2mL灭菌的离心管，向其中加入500 u L, pH6. 95-7. 05，2XHEPES缓冲液，向HEPES缓冲液中以吹气的方式逐滴滴入外源质粒DNA-CaC12溶液； (4)将试管放于37°C水浴中孵育3-5min，可见乳白色混浊出现；(5)10000 r/min离心3 min,弃上清；所得的混合物即为磷酸I丐-外源质粒DNA。所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的(1)采用灭菌蒸馏水与蔗糖，配成浓度为8%的蔗糖溶液，115°C灭菌15-20min ； (2)取上述蔗糖溶液与TWeen20混合，制成浓度为5%的TWeen20保护剂； (3)取5%的Tween20保护剂10-20u L外源质粒DNA。本专利技术提供了，分别采用氢氧化铝溶胶、磷酸钙和TWeen20作为外源质粒DNA保护剂，利用植物花粉管通道法转化外源基因，受体烟草和大豆GUS活性组织化学染色结果表明，以氢氧化铝溶胶作为DNA保护剂的gus阳性率分别为11.1%和3. 76% ;以磷酸钙作为DNA保护剂的gus阳性率分别为8. 89%和2. 91% ;以Tween20作为DNA保护剂的gus阳性率分别为10. 0%和I. 41% ;以IXSSC溶液作为DNA保护剂的gus阳性率分别为7. 78%和I. 97%，提高了转化率。附图说明图I转基因烟草抗性植株； 图2转基因大豆抗性植株； 图3烟草抗性株PCR产物检测结果； 图4大豆抗性株PCR产物检测结果； 图5转基因烟草根部、叶片和种子GUS活性组织的化学染色结果，其中，5-A为根部；5-B为叶片；5-C为种子； 图6转基因大豆种子和叶片GUS活性组织的化学染色结果，其中，6-A为种子；6-B为叶片。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。具体实施例方式 实施例I植物表达载体PCAMBIA1301质粒DNA的提取 按照质粒DNA常规提取方法-碱裂解法，从含有植物表达载体pCAMBIA1301的大肠杆菌中提取质粒DNA。实施例2氢氧化铝溶胶保护剂的制备 (1)在一支玻璃试管中加入2-4mL1%氯化铝溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀； (2)弃上清，用蒸馏水清洗沉淀3-5次，采用倾析法除去水分，最后一次用过滤法使洗液与沉淀分离； (3)将沉淀转入150mL烧杯中，加入蒸懼水20-80 mL,搅拌并加热煮沸。期间加入0.1-0. 2 mL 0. I mol/L HCl溶液，不断搅拌，即可获得氢氧化铝溶胶； (4)取少许氢氧化铝溶胶重悬实施例I中所提取的pCAMBIA1301的质粒DNA沉淀，获得的混合物即为氢氧化铝溶胶-pCAMBIA1301，pCAMBIA1301的质粒DNA的浓度为0. 8-1. 2y g/ y L0实施例3磷酸钙保护剂的制备 (I)用灭菌蒸馏水5-15 U L重悬实施例I所提取的pCAMBI1301的质粒DNA沉淀，使其浓度为I Ug/yL，再加入50-60 UL 2 mol/L CaC12溶液混匀，此时会有少量混浊物质出现。(2)12000 r/min离心10 min,将上清液取出，加入到400-450 U L灭菌蒸懼水中，此即称为pCAMBIA1301-CaC12溶液。(3)取一个2 mL灭菌的离心管，向其中加入500 u L 2XHEPES缓冲液(pH6. 95-7. 05)，向HEPES缓冲液中以吹气的方式逐滴滴入pCAMBIA1301_CaC12溶液。(4)将试管放于37°C水浴中孵育3-5 min，可见乳白色混浊出现。(5) 10000 r/min离心3 min,弃上清。所得的混合物即为磷酸I丐_pCAMBIA1301,PCAMBIA1301 的质粒 DNA 的浓度为 0. 8-1. 2 u g/u 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：将外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，制成外源质粒DNA的混合液；浓度为0.8？1.2？μg/μL，然后利用植物花粉管通道法转化到植物中。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王丕武，付永平，张君，曲静，姚丹，马建，王鑫雨，单睿，关淑艳，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：
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