花粉介导的植物的转化制造技术

本发明专利技术揭示了用于花粉介异的转化的植物和植物系的遗传转化的方法和装置。通过在以物理方式加速进入植物花粉中的载体微粒上的涂复把外源基团引入花粉中。然后用手使经处理的植物花粉授粉，重获后代，其中部分后代将在它们的染色体组织中含有外源基因。该工艺可以用于建立遗传工程玉米植物和玉米植物系。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物遗传工程的一般领域，具体地说，涉及通过以物理方式将传遗物质引入到植物花粉之中使外源的遗传物质进入到一种植物系的种系的转化。目前，人们正大力致力于植物种的基因转化方面研究。据认为，把外源基因转入植物种系的有效手段的发展将使重要的经济作物种的遗传材料的多样性得到扩大，并能把特别感兴趣的功能基因有选择地引入作物种。以往关于植物种的转化或者遗传工程方面的努力和研究已取得一些成果，这些成果极其明显地取决于植物的种。以往业已用作把外源基因引入植物的主要机构是从作为原生质体或者在称之伤愈组织的未经分化的组织中的单一植物细胞的转化开始。有人通过electroporation和显微注射将在植物细胞中起作用的嵌合基因引入到单胞植物的原生质体。然而，以往最广泛采用的转化技术是利用植物病原体根癌病土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的天然特征的优点，它具有天生的能力可把部分DNA从藏于其中的Ti(Tumor-inducing)质粒转入感染的植物细胞之中。通过把外源基因插入到带有来自Ti质粒的某些顺序的土壤杆菌中的一些质粒中，细菌的转化特征可以被用来把外源基因输入到经感染的植物细胞的染色体组。业已发现，土壤杆菌介导的植物细胞的转化作用可用在许多典型的作物种例如烟草、矮牵牛属植物及胡萝卜中得到应用，但是它有两个很大局限性。第一个局限性是，介导作用只能在细胞水平上例如用体细胞组织进行，然后必须用人工方法使它们再生为整株植物。这就限制了土壤杆菌介导的杆菌遗传转化在那些可容易地从易感染土壤杆菌各种类型组织再生的作物中的可应用性。第二个局限性是土壤杆菌的天然宿主范围仅包括双子叶植物和有限的几个Liliaceae科的单子叶植物种。因此，尚未证明，土壤杆菌介导的转化作用对有商业价值的单子叶植物种，如谷类作物种是有效的工具。采用土壤杆菌介导的转化的另一个困难在于体细胞无性系变异体的产生，体细胞变异体在组织培养中的植物组织是自发地出现，从而可使转化突变型(转移基因接受体)的鉴定复杂化。业已证明，至少某些嵌合基因的结构对外源基因在多数植物细胞中的表达是有效的。采用如electroporation一类技术对培养中的玉米原生质体的转化已证明这些嵌合结构在单子叶植物及双子叶植物中的功能度。然而，目前尚没有建立起从这种原生质体再生整株玉米或者整株其它任何重要作用物的一套方法。公知的是非整株、完整的转化的玉米植物已生产出来。尽管如此，玉米和其它作物的遗传转化是一个人们所期望的目标，因为这种普通作物具有很大的农业价值，并且有潜力可提高它们的价值和产量。以往，至少有一种建议，即通过玉米花粉的遗传转化可以在遗传上使玉米转化。Dewet的公开的PCT专利申请WO85/01856大致上描述了一种通过植物花粉的转化把外源基因转移到显花植物的方法。其他人证实这一技术以及重复该实验的试图均遭失败。参见Sanford等人，Theor.Appl.Genet.，69(5-6)，571-74(1985)。业有人作出得到相似结果的报告。参见Ohta，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83∶715-719(1986)。本专利技术概括为一种从遗传上使植物系转化的方法。所说的方法包括以下步骤制备一种包含外源基因和调节顺序的DNA顺序;将DNA顺序涂盖在生物学上的隋性的微粒上，用物理学方法使带有DNA的微粒向植物的花粉加速，以致该微粒进入并固定在花粉中;用所说的花粉使雌性亲本授粉;从授粉的后代中选择转化植物。本专利技术还对准具有在插入到它们的功能表达的外源基因的玉米系。本专利技术的另一个目的在于通过花粉转化以及在不需要植物的组织培养或者再生的情况下，不仅对玉米而且对其它重要的作物，进行遗传转化。本专利技术的优点在于所说的方法是快而有效，易于检证和重复。本专利技术的所说方法和由此所生成物质的优点在于可以简便快速地把经鉴定或未经鉴定的外源遗传物质引入到用于作物育种、分子生物学或者其它相似的农学或科学的目的的玉米的任何要求的遗传背景之中。本专利技术的方法的另一个优点在于要得到无数的即几千个转化突变型是可能的和行得通的，因为与难以实施或者要求一个细胞一个细胞地处理的已有的体细胞转化技术或者显微注射相比，实施本方法是容易的。本专利技术的其它目的、优点以及特点通过以下结合附图的说明将会更加清楚。图1为实施本专利技术方法的装置的分解透视图;图2为制作质粒pCMC 1208的方法中的质粒操作的图解说明;图3为制作质粒pCMC 1022的方法中的质粒操作的图解说明。在根据本专利技术所进行的花粉介导的植物遗传转化的实践中，以物理的方式把DNA传递到植物花粉的细胞溶质中，把DNA带到生物学上隋性的物质的单个小微粒上，使所说的微粒向花粉加速，以致于所说的微粒进入单个花粉细胞，但是既没有破坏它们也没有使它们失去能力。业已发现，以这种方式供给的DNA将被结合在该花粉的后代的遗传物质中。以这种方式所得的转化花粉可供植物和植物系的遗传工程应用。有几种因素影响花粉介导的的转化的成功。其中使微粒加速的方式要优先仔细地安排，以使各个带有DNA的微粒具有适合的动量和速度，并且微粒本身应处于较均匀的图式中，当接触花粉时，它们穿过大量花粉细胞，并没有在生物学上使它们失去能力。因此，微粒上的DNA应当是稳定的，而且能使植物细胞转化和表达植物细胞中的所要求的特征。此外，DNA本身可含有一种可供选择的标记物，该标记可在已推定转化了的植物种子或者植物苗中被测到，以便证明该特定植物已发生遗传转化。如果转化频率足够高，那么这种可选择的标记物就不需要采用。可以预见到加速生物学上隋性的小载体微粒的机械系统有多种类型。可能的装置可包括微粒的弹道式爆炸加速、微粒的离心加速、微粒的静电加速或者能够给小的隋性微粒提供动量和速度的任何其它类似的系统。图1以图解方式说明了申请人优先采用的一种新的方法。这里所说明的方法采用由高压放电产生的冲击波。在图1中和通常以10表示的是用所说的方法加速隋性微粒用的加速器。如图1所示，一般以22表示的是用于在其上带花粉靶子的靶子表面。加速器10是由几部分组成。火花放电室12设有一对电极14，延伸到它的内部。火花放电室12的几何形状对本专利技术来说并非至关紧要，只要该室被配置到能产生和提供具有可用于推动载体微粒的合适的特性和合适的方向的冲击波。申请人发现，内径为13毫米的聚氯乙烯塑料管的一段对用作火花放电区12是满意的。电极14以相对的两侧延伸到管的内部，设置在低于火花室12顶大约5毫米处。电极14本身由螺纹螺栓构成，延伸到在火花室12壁本身的内侧壁表面中形成的合适的螺纹中。构成电极14的螺纹螺栓的端部均用高压继电器上断开的触点的耐电弧合金保护，其尺寸为大约2毫米×2毫米×3毫米，并且焊接在螺纹螺栓的端部。通过适当地把螺栓旋进或旋出火花室12可调整电极14之间的间隙。电极端部之间的放电电压大约为15千伏时的最佳间隙为1-1.5毫米。电极14本身的制作和安装的方法显然有多种方式，尽管优先采用的电极是相当耐用的，电极之间的放电间隙的距离要易于调整。火花室12上面设有间隔圈16。间隔圈16可以由与火花室12相同的PVC管构成，最好切割成垂直长度为6毫米。在用于单一作物种转化的固定装置中，间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培育经遗传转化的植物系的方法，其特征在于所说的方法包括以下步骤：制备包含编码区和侧翼调节顺序有效地在植物细胞中表达编码区；的外源基因的拷贝；将外源基因的拷贝连接在生物学上隋性的载体微粒上；用物理方法以下列方式使带有嵌合基因拷 贝的微粒向植物的花粉加速，以这种方式使某些微粒射入某些花粉的内部；用经上述处理的花粉使植物的雌性器管授粉；以及在这种授粉所产生的后代中筛选出已转化的后代。

【技术特征摘要】
US 1986-12-5 938570的范围内。还应当指出，核苷酸所给出的全部碱基对的尺寸都是近似的，并供叙述用。权利要求1.一种培育经遗传转化的植物系的方法，其特征在于所说的方法包括以下步骤制备包含编码区和侧翼调节顺序有效地在植物细胞中表达编码区；的外源基因的拷贝；将外源基因的拷贝连接在生物学上隋性的载体微粒上；用物理方法以下列方式使带有嵌合基因拷贝的微粒向植物的花粉加速，以这种方式使某些微粒射入某些花粉的内部；用经上述处理的花粉使植物的雌性器管授粉；以及在这种授粉所产生的后代中筛选出已转化的后代。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的生物学上隋性的微粒是金属微粒。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的金属微粒是金小球。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的方法在将嵌合基因拷贝连接在金属微粒上之前还包括用包复剂涂复金属微粒的步骤。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所说的包复剂为聚赖氨酸(Polylysine)。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所说的将外源基因拷贝连接到金属微粒上的步骤包括干燥微粒上基因拷贝的溶液。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所说的基因拷贝溶液包括与基因拷贝一起沉淀在金属微粒上的CaHPO4。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于以物理方法加速微粒的步骤包括使微粒在平面承载板上成层，通过冲击波冲击承载板使其加速以及制止承载板，以致载体微粒的动量使其离开所说的板。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于产生冲击承载板的冲击波是由高压经水滴搭桥的火花间隙放电产生。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的使微粒向植物花粉加速的步骤包括把单层花粉铺设在靶表面上和把靶表面设置在载体微粒的加速通道中。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于把花粉铺设在靶表面上是由把一层矿物油施加在靶表面上，把花粉撒在其上以及由此去除多余的花粉来实现。12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使植物雌性器官授粉的步骤是由用刷子从靶表面刷下微粒已被加速进入花粉之中的花粉和把那种花粉撒在经选择的母本植物的雌性器官上来实现。13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在后代中的筛选是基于生化试验作出的。14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所说的试验是抗菌素抗性试验。15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在后代中的筛选是基于形态学的植物特征作出的。16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说的植物是玉米。17.用权利要求1的方法遗传转化的一些植物。18.用权利要求1的方法遗传转化的玉米植物。19.一种培育遗传转化的玉米植物的方法，其特征在于所说的...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼斯E麦卡布，威廉F斯温，布赖恩J马丁奈尔，
申请(专利权)人：阿格拉塞特斯，
类型：发明
国别省市：US[美国]