本发明专利技术公开了一种改变植物花器官形态的方法及其专用表达载体。本发明专利技术所提供的用于改变植物花器官形态的表达载体，下述ａ）或ｂ）的重组植物表达载体：ａ）在植物表达载体的多克隆位点插入ＬｆＭＡＤＳ１基因片段得到的重组正义或反义表达载体；ｂ）在植物表达载体的多克隆位点插入ＬｆＭＡＤＳ３基因片段得到的重组正义或反义表达载体。本发明专利技术能够广泛应用于观赏植物的花型育种，从而得到重瓣花等多种花器官变异。而且基因工程育种还具有受体广泛，不受品种约束；育种时间短；只改变目的性状而不影响其他性状的优点，这些优点是辐射育种和杂交育种所不具备的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种改变植物花器官形态的方法及其专用表达载体。技术背景虽然通过辐射诱变能够得到无花粉的不育系，通过杂交能够得到重瓣花，但是 这两种方法却都不能一次性达到去除花粉和增加花瓣的目的。辐射育种虽然达到了 去除花粉的目的，但也会影响或改变植物的其他性状，而且辐射产生的诱变呈多向 性，多数的性状改变是对植物不利的；杂交育种需要寻找自然界中存在的重瓣资源， 然后需要较长的育种周期才能培育出具有商业价值的观赏植物品种。花发育的分子生物学研究表明，花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊4轮花器官的发育， 是由A、 B、 C三类不同功能的具MADS-box的同源异型基因调控的，即花器官发育 的ABC模型。随着科学的不断发展，花发育的ABC模型又增加了两类基因D功能 基因和E功能基因，其中D功能基因控制胚珠的发育，而E功能基因在叶片同源变 异成花器官的过程中起着重要作用，参与各轮花器官的形态建成。其中C功能基因 的突变，将产生雄蕊变瓣和台阁花等重瓣花型的突变体。Z/細"57 cDNA的片段长846bp,包括编码192个氨基酸的0RF的3，端和长270bp 的3，非编码区(GenBank序列号AY829227)，该片段与玉米、水稻等多种单子叶 植物的AG同源基因具有较高的同源性(张云，刘青林，欧阳青，蔡文启.百合花 发育相关MADSBox基因的克隆。园艺学报，2004， 31 (3) : 332—336) 。 Z/厕ZIS3 cDNA片段长797bp，编码200个氨基酸，3，非编码区长197bp (GeneBank序列号 AY826062)，与拟南芥的SEP组基因同源性较高(张云等，2004)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种改变植物花器官形态的方法及其专用表达载体。 本专利技术所提供的用于改变植物花器官形态的表达载体，是下述a)或b)的重 组植物表达载体a) 在植物表达载体的多克隆位点插入Z/鹏"57基因片段得到的重组正义或反义 表达载体；b) 在植物表达载体的多克隆位点插入Z/J^"5^基因片段得到的重组正义或反义表达载体。其中，所述Z/細"57基因片段的核苷酸序列具体可为GenBank Accession Number AY829227的自5'末端第249 bp至745 bp，含有部分K-box;所述Z/鹏"5^ 基因片段的核苷酸序列具体可为GenBank Accession Number AY826062的自5'末 端第249bp至623bp，含有部分K-box。现有的植物表达载体均可用来构建本专利技术的用于改变植物花器官形态的表达 载体，如pBin438 (中国科学院微生物研究所。其结构见李太元、田颖川、秦晓峰 等."高效抗虫转基因烟草的研究".中国科学(B辑)，1994， 24 (3): 276 — 282 )。 所述重组正义表达载体具体可为将Z/y^Z 67基因片段插入pBin438的Sail和BamHI 位点间得到的重组表达载体pBinZ/湖"57;所述重组反义表达载体具体可为将Z/i^"57基因片段插入pBin438的Sail和 BaraHI位点间得到的重组表达载体pBinZ/湖Z 57intisense,或为将Z/F^95^基因 片段插入pBin438的Sail和BamHI位点间得到的重组表达载体 pBinZ^Mfl5"< ~ant i sense 。本专利技术所提供的改变植物花器官形态的方法，是将上述任一种用于改变植物花 器官形态的表达载体导入目的植物中，得到花器官形态改变的植物。所述花器官形态改变具体可为花药缺失，所述用于改变植物花器官形态的表达 载体为上述pBin力iMQ57"antisense。所述花器官形态改变具体还可为花萼瓣化，所述用于改变植物花器官形态的表 达载体为上述pBinZ/M4"57。所述花器官形态改变具体还可为雄蕊缺失，或苞叶瓣化；所述用于改变植物花 器官形态的表达载体可为上述pBin丄f鹏Z 5^int isense。本专利技术改变植物花器官形态的方法适合于单子叶植物和双子叶植物。和Z/i/^^J经序列分析分别属于C功能和E功能基因，根据花发育理 论，将构建的4个植物表达载体pBinZ/M"57、 pBi"/厕Z 5^、 pBinZ/朋"57-antisence和pBinZ/細"^53-antisence转化烟草后，发生的一系列花 器官变异足以证明它们具有改变花型的功能。本专利技术能够广泛应用于观赏植物的花 型育种，从而得到重瓣花等多种花器官变异。而且基因工程育种还具有受体广泛， 不受品种约束；育种时间短；只改变目的性状而不影响其他性状的优点，这些优点 是辐射育种和杂交育种所不具备的。附图说明图1为pBinZf厕"57、 pBi/2Z/厕"5^、 pBinA/湖"57intisence禾口pBinZ/湖"5"J-antisence的结构示意2为pBinZ/鹏"57、 pBi刀Z/細"5^、 pBinZ/M4"57intisence禾口pBinZ/細仍， -antisence的Sail和BamHI双酶切鉴定图谱 图3为转基因烟草的抗性芽及愈伤组织照片 图4为转pBinZ/掘"57或pBi/ Z/JfA05^烟草的PCR检测图谱 图5为转pBinZ/￥^"57~antisence或pBinZ/vMO^-antisence烟草的PCR检测图谱图6为pBinZ/厕"57intisence或pBinZ/￥/^53-antisence Tl代烟草 PCR-Southern检测图谱图7为转基因烟草花器官变异表型照片具体实施方式步骤l载体构建本专利技术已构建4个植物表达载体pBinZ/細"57、 pBinZ/M4/ 5^、 pBin^/湖Z 57—an1:isence禾口 pBin^/MlflS^—antisence。 步骤2转化目标受体将上述植物表达载体通过电激法转入具有利福平和卡那霉素抗性的根癌农杆 菌LBA4404中(菌种可根据实际情况更换)，培养单菌落，接种到加入利福平和卡 那霉素的YEP液体培养基上，于250rpm摇床上28"C过夜。次日，将菌液用共培养 液稀释30—50倍，浸染目标受体，共培养若干天，然后用无菌水冲洗3次，洗掉 残余的根癌农杆菌，转移至含筛选抗生素Kan和抑菌抗生素Carb的筛选培养基上， 每3周更换一次筛选培养基，最后诱导抗性苗生根。步骤3抗性植株的PCR检测当抗性植株长至3—4 cm高时进行基因组DNA的PCR检测。DNA的提取采用CTAB法。取农杆菌落作阳性对照，未转化植株DNA和水作阴性对照，和抗性植株的DNA 同时进行PCR检测。步骤4 PCR-Southern检测取PCR检测阳性的植株的DNA，如上所述设置阳性和阴性对照，再次进行PCR。 将PCR产物稀释103-105倍后，取lul滴于杂交膜上，UV交联，然后进行以地高辛 标记的Southern检测，最终呈现阳性的植株为转基因植株。 步骤5表型观测移栽转基因植株，待开花后观测转基因植株的花型变化。 5、本专利技术的工作过程以4个植物表达载体pBinZ/y^必7、 pBin^f厕"M、 pBin乙/yJ^"57-antisence和 pBinZ/M4"6^-antisence的构建、烟草转化和转基因烟草的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于改变植物花器官形态的表达载体，下述ａ）或ｂ）的重组植物表达载体：ａ）在植物表达载体的多克隆位点插入ＬｆＭＡＤＳ１基因片段得到的重组正义或反义表达载体；ｂ）在植物表达载体的多克隆位点插入ＬｆＭＡＤＳ３基因片段得到的重组正义或反义表达载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘青林，赵印泉，张云，弥志伟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[]
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