一种酶工程法生产d-α-生育酚的方法技术

本发明专利技术涉及一种酶工程法生产d-a-生育酚的工业化方法。该方法通过γ-生育酚甲基转移酶将d-β、d-γ、d-δ生育酚转化为d-α-生育酚，以区别于化学合成的金属催化剂甲基的转化。这种方法效率高，无污染，生产真正意义上的纯天然d-α-生育酚产品，即纯的右旋α-生育酚。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及ー种d-a -生育酚生产技木，特别是ー种酶工程转化生产d-a -生育酚的方法，属于生物制品技术类。
技术介绍
维生素E(VE)是人类营养的必需成份，具有促进人体能量代谢、防止血管硬化、保肝、调整性腺功能、延缓衰老和抑制游离基等多种生理功能，是治疗和辅助治疗一系列疾病的有效药物，在抗不育、抗癌、抗衰老、治疗冠心病、心肌梗塞和血栓、动脉硬化、増加机体免疫力、提高血液中氧的利用率和肌肉持久力等方面都具有重要作用，可用于医药エ业、食品エ业、化妆品エ业等多个领域。维生素E是生育酚类化合物的总称。它不仅是ー种常用的药品兼营养保健品，在其他领域也有许多重要的用途。商品维生素E可分为天然维生素E和合成维生素E两类。·天然VE是以富含维生素E的天然油脂为原料，经适当加工得到的由d-a、d-0、d_ Y、d_ 6生育酚构成的混合物。目前天然VE占全球VE总商品量的30%左右。维生素E已成为国际市场上用途广泛、产销量较大的主要维生素品种，同VC、VA 一起成为维生素系列的三大支柱产品。天然维生素E比合成维生素E安全性高，生理功能好，发展非常迅速，国内外市场前景极为广阔(天然维生素E生产技术现状.湿法冶金2003年9月，第22卷第3期(总第87期))。目前国内制备天然VE以脱臭馏份为原料，脱臭馏份经过酯化、中和、分层、冷析分离分层、蒸馏得30%天然VE祖品，超临界萃取或正己烷萃取，可得80%以上的天然VE混合液。脱臭物制备天然VE浓缩液的技术已经较为成熟，エ业收率可达60%左右。特别是北京化工大学、上海交大、清华大学等开发成功分子蒸馏、超临界萃取等天然维生素E提取分离新技术，加快了天然维生素E产业化进程。国内已有多家企业采用脱臭馏份为原料生产天然维生素E。但是制得的维生素E产品是d-a、d-P、d-Y、d-S生育酚构成的混合物，并且成本高。上述产品中d-a -生育酚的纯度在5-15%，达不到国际标准。采用上述エ艺制备的天然维生素E浓缩液，实际上是d-a，d-^ , d-Y , d-6生育酚的混合物，其中，d-a生育酚的生物活性最高。由于原料的差异，所得到的组成成份差别较大，导致生物活性的差别也较大。为了提高生物活性，国内以天然VE混合液为原料，将d-P-，d-Y-和d-S生育酚转化为d-a生育酚，増加天然VE的生物活性，国外标准d- a -生育酚纯度98%，中国标准纯度90%。国内外多家科研院所针对从油渣制备维生素E进行了大量研究，但目前尚未实现エ业化。用油渣制备天然维生素E，一方面可以产生较好的经济效益，对于油渣综合利用、环境保护具有现实意义。目前国外以油渣为原料，カロ入酶和缓冲液进行处理，直接得到混合天然维生素E，然后经过金属催化剂将d- 3，d- Y，d- 8 -生育酚转化为d-a -生育酚，这种制造方法仍然是化学合成方法。我们的研究是采用酶工程方法转化制备d-a -生育酚，这种方法效率高，无污染，具有良好的发展前景，在国际上处于领先地位，可用于エ业化应用。天然维生素E的效カ是合成维生素E的5倍以上。天然VE以其良好的抗氧化功能和安全性得到广泛应用，国外医药，食品，化妆品必须使用天然维生素E(USP美国标准)。近年来天然维生素E需求量超过合成维生素E的增长速度，年均增长率为15%左右。但由于其产量的增长受限于原料来源，不能满足市场需求，处于卖方市场，价格逐年上升，目前已高出合成维生素ElO倍以上。此外，我国具有发展天然维生素E的丰富原料资源。中国是世界上油料生产大国，大豆、花生和菜籽等油料作物的年产量分别为1800万吨、1100万吨和1000万吨。年食用油的总产量1000万吨。随着人民生活水平的不断提高，色拉油消费量不断増加，广东、北京、上海、江苏、山东、河南等省市已建有近30家大型色拉油加工厂，毎年副产大量的油渣，为天然维生素E的生产提供了丰富的原料。植物油精炼后油渣中含有质量分数5%的天然维生素E (天然维生素E生产现状与应用前景.化工技术经济2002年，第4期)。国内将榨油后的油渣作为肥料，没有利用开发，所以利用“生物技术”从油渣提取天然维生素E是关键。因此，探寻ー种利用我国丰富的油渣原料来生产对人体无害的天然维生素E的方法，就成为该
研究人员的ー个重要课题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用酶工程法生产d- a -生育酚的方法。该方法既不同干现有的用重金属催化生产d- a -生育酚的合成方法，也不同于将Y -生育酚甲基转移酶导入转基因植物生产a-生育酚的方法。国内外a -生育酚的生产方法很多,如三甲基氢醌与异植物醇的化学合成法；a -生育酚的两步合成法(如羟甲基化-还原法、氯甲基化-还原法、胺甲基化-还原法和酰甲基化-还原法)，由于天然生育酚都是右旋的，甲基化反应只能发生在苯环上，侧链上的碳原子构型不会受到影响，所以化学金属催化甲基化后的产物基本上也都是具有旋光性的d- a -生育酚(植物维生素E合成相关酶基因的克隆及其在体内功能研究进展.植物学通报2006年，23 (I) :68-77)。本专利技术是要探索一种无害化，低成本的エ业化生产d- a -生育酚的方法，生产真正意义上的纯天然a -生育酚产品，即纯右旋a -生育酚(d- a -生育酚)，真正地造福于人类。这种d-a -生育酚的生产方法，其特征在于向混合生育酚中加入Y-生育酚甲基转移酶(Y -tocopherolmethyItansferase, y -TMT)。Y -TMT 是光合生物维生素 E 生物合成途径中的最后ー个酶，它催化d-Y -生育酚甲基化形成生物活性最高的生育酚d- a -生育酚。本专利技术利用的原料是混合生育酚，混合生育酚在市场上有很多公司出售，它来自食用油精炼过程中产生的下脚料--脱臭馏出物，脱臭馏出物中维生素E的含量随油脂精炼エ艺的不同而不同，一般在3 8%范围。本专利技术使用的￥づ1^利用集胞藻？06803或聚球藻1^1(10224制备，具体方法如下将集胞藻PCC6803或聚球藻MBIC10224(均购自中国科学院上海植物研究所)在培养液中培养，获得含有大量Y-生育酚甲基转移酶的菌液，随后通过离心分离浓缩的方法、或者是用こ醇萃取浓缩和冷却的方法获得Y-生育酚甲基转移酶。本专利技术的酶工程法生产d-a-生育酚的方法，其特征在于，包括以下步骤A、取100克混合生育酚，加热至50 75°C，在搅拌下加90%こ醇溶液200克，カロ2%的三甲胺反应2小时；B、加入90%的Y-生育酚甲基转移酶2毫克进行转化12-24小吋；C、萃取、水洗、干燥、浓缩和分子蒸馏得d-a -生育酚。本专利技术人经过大量实践，优化了实验參数，摸索出上述实验条件，出人意料的发现d-^,d-y,d-6-生育酚的转化率超过90 %。本专利技术的酶工程法生产d-a-生育酚的方法，具体来说，包括以下步骤A、首先取2. 2L，pH值为7.4的O.OlnM LB培养基，将其在121°C下灭菌10分钟，而后加入2克集胞藻PCC6803，使其在28°C、转速300rpm条件下进行48小时的藻细胞培养；B、向培养液中注入摩尔浓度为0. 12mM的枸櫞酸30mL，并对加酸处理后的培养液进行离心分离处理，将分离后获得的细胞沉淀用纯水洗涤数次获得洗浄的藻细胞体；C、最后使用Mul本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种d？α？生育酚的生产方法，其特征在于，向混合生育酚中加入γ？生育酚甲基转移酶。

【技术特征摘要】
1.ー种d-a-生育酚的生产方法，其特征在于，向混合生育酚中加入Y-生育酚甲基转移酶。2.如权利要求I所述的d-a-生育酚的生产方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 A、取100克混合生育酚，加热至50 75°C，在搅拌下加90%こ醇溶液200克，加2%的三甲胺反应2小时； B、加入90%的Y-生育酚甲基转移酶2毫克进行转化12-24小时； C、萃取、水洗、干燥、浓缩和分子蒸馏得d-a -生育酚。3.如权利要求I或2所述的d-a-生育酚的生产方法，其特征在于，所述Y-生育酚甲基转移酶由集胞藻PCC6803或聚球藻MBIC10224制备。4.如权利要求3所述的d-a-生育酚的生产方法，其特征在于，所述Y-生育酚甲基转移酶由集胞藻PCC6803制备，包括以下步骤 A、首先取2.2L DMEM-I培养液，将其在121°C下灭菌10分钟，而后加入2克集胞藻PCC6803，使其在28°C环境下，在转速300rpm条件下进行48小时的细菌培养； B、向培养液中注入克分子浓度为25%的枸櫞酸30毫升，并对加酸处理后的培养液进行离心分离处理，4°C，5000rpm, 30分钟，将分离后获得的含水物用纯水洗涤数次获得洗净的细菌体； C、最后使用MulitibeadsshockerB300振荡，振荡频率60次/毎分，振幅20MM，振荡I小时后，使细菌体破碎，离心分离得到沉淀物； D、将上述沉淀物放入作为提取溶剂的30%こ醇溶液中，在20°C下搅拌30分钟后，进行离心分离，4°C，5000rpm，30分钟，然后除去こ醇溶液相； E、再次加入95%こ醇，...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊军，娄彩玲，李国兴，陈芝荣，单晓昌，
申请(专利权)人：熊军，
类型：发明
国别省市：